Кальций изображений запаха, вызвали ответы на Drosophila Усиков лепестка

Summary

Мы описываем создана методика для измерения и анализа запахов вызвали ответы кальция в усиков доля живых<em> DROSOPHILA MELANOGASTER</em>.

Abstract

Усиков доли является основной обонятельный центр в мозге насекомых и представляет собой анатомический и функциональный эквивалент позвоночных обонятельные луковицы ^1-5. Обонятельной информации из внешнего мира передается усиков доли на обонятельные сенсорные нейроны (OSNs), который разделения на отдельные регионы нейропиля называется клубочков в зависимости от конкретных обонятельных рецепторов они выражают. Здесь OSN аксоны синапс с местными интернейронов (LNS), чьи процессы иннервируют разные клубочков и проекционных нейронов (ПНС), которые передают обонятельной информации в высшие обонятельной области мозга.

Оптическое изображение деятельности OSNs, LNS и векселей в усиков доля – традиционно с использованием синтетических показателей кальция (например, кальция, зеленый, FURA-2) или напряжение чувствительных красителей (например, RH414) – уже давно важная техника понять, как обонятельные стимулы представлены в виде пространственной и временной структурыклубочковой деятельности у многих видов насекомых, ^6-10. Развитие генетически закодированных нейронных журналистам деятельности, таких как люминесцентные индикаторы кальций G-Camp ^11,12 и Cameleon ¹³ биолюминесцентного показатель кальция GFP-aequorin ^14,15, или репортер синаптической передачи, synapto-pHluorin ¹⁶ сделал обонятельная система fruitfly, дрозофилы MELANOGASTER, в частности, доступны для нейрофизиологических изображения, дополняя ее всесторонне описанная молекулярная, электрофизиологические и нейроанатомических свойства ^2,4,17. Эти журналисты могут быть выборочно выражается через двоичный транскрипционных систем управления (например, GAL4/UAS ¹⁸ LexA / LexAop ^19,20, Q системы ²¹⁾ в определенной популяции нейронов в обонятельных схему препарировать с высоким пространственным и временным разрешением как запах вызывал нейронной активности представляется, модулированные и превратил ^{22-24 <}/ Sup>.

Здесь мы опишем приготовление и анализ методов измерения запах вызывал ответ у дрозофилы усиков доли использования G-лагерь ^25-27. Животных препарат минимально инвазивных и может быть адаптирована для визуализации с использованием широкого поля флуоресценции, конфокальной и двухфотонной микроскопов.

Protocol

1. Монтаж блоков Ассамблеи Плексиглас монтажный блок (рис. 1А), должны быть сделаны точные спецификации приведены в проект (имеется в http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint / ), Что позволяет легко монтажа и вскрытия лету. Тема через винты обратно, но не выходят за пределы их передней части блока, их положение будет корректироваться в процессе подготовки животного (см. п. 2.7). Использование точных дрель, пробить брешь в верхней границе круговой камере лету, копать под поверхностью, чтобы освободить место для тела мухи, уменьшение толщины блока на данный момент. Вырезать медную сетку с помощью скальпеля перпендикулярно и близко к нижней части разреза, чтобы создать "воротник". Убедитесь, что два полученный закрылки уровне, так как это поможет вставки лету. С помощью зубочистки, положите небольшую каплю суперклея на монтажном блоке над круговой камере лету. Установите медную сетку на клей и положение так, чтобы щель по центру блока (рис. 1а). Нажмите мягко и удалите излишки клея. С пинцетом, добавить капельки клея в соответствии с закрылками на каждой стороне и сложить сетку на передней панели блока так, чтобы щель указывает прямо вниз. Убедитесь, что в верхней части сетки на одном уровне с блоком. Дайте высохнуть полностью. Соберите держатель проволоки: резать пластик покровное пополам и удалить центральную часть, чтобы сделать "U" формы. Использование воска на клей кусок проволоки по всей верхней части "U", не делайте провод слишком тугой. Построим усиков щит: сделать отверстие в пластиковой покровное с бумаги с перфорацией. Обрезать края покровного стекла до 0,5 х 0,7 см. Клей пронзил пластиковых покровное на липкую ленту, а затем поместить каплю спирта на ленте доступны через отверстиеудалить клей. 2. Подготовка животных Мухи соответствующего генотипа – то есть принимая нужную комбинацию "водитель" и деятельности, репортер трансгенов – должно быть 1-3 недель; кутикулы младшего мухи слишком мягкий и трудно резать. Когда эксперименты требуют прямого сравнения различных генотипов, и для того, чтобы соответствовать уровень экспрессии трансгена, мухи должны быть соответствующего возраста, чтобы избежать возрастных физиологических различий. Если пол не важен, мы предпочитаем использовать женский мухи, так как они имеют большие головы и легче манипулировать. Обезболить мух при охлаждении на льду. Ввести единый лету в монтажный блок. Держите лету крыла совместных и сдвиньте его спинной поверхности сначала вдоль щели медную сетку так, чтобы она приостановила его шеи (рис. 1B-C). При необходимости, поверните его, пока он смотрит вниз. Поместите тонкий позвоночник кактус перед еют головы, чтобы предотвратить его от побега (рис. 1B-C). Поместите позвоночника кактус перед хоботок, чтобы предотвратить его перемещение. Закрепите позвоночника кактус в блок с помощью воска. Убедитесь, что в верхней части головы на одном уровне с верхней части блока. Закрепите глава лету блок с небольшим падением канифоли (растворяли в этаноле). Поместите блок в увлажненном окно и позволить канифолью, чтобы укрепиться в течение приблизительно одного часа. Используя пинцет, вытащите усиков пластину вперед и падение провода на держателе (воск-наружу, см. п. 1.5) в кутикулярной складкой между антенной и головой. Закрепите держатель на передней панели блока с пчелиным воском. Используя винты встроены в блок, аккуратно вставьте держатель проволоки вперед, чтобы создать некоторое пространство между усиков пластины и головки. Поместите усиков щит (см. 1.6) поверх головы мухи с отверстием по центру. Исправлено с пчелиным воском, чтобы в верхней части монтажного блока. С помощью лезвия-сплиттер, у.е.та маленькое отверстие в ленте на щите подвергая кутикулы головы мухи за антенну. Отверстие не должно выходить за пределы глаза, чтобы предотвратить утечку подготовки. Закройте отверстие между лентой и кутикулы с двухкомпонентным кремния. Удалите излишки кремния из верхней части головы мухи. Поместите каплю Drosophila Рингера раствор (130 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ MgCl 2, 2 мМ CaCl 2, 36 мМ сахарозы, 5 мМ HEPES, рН 7,3) на голове. Убедитесь, что нет утечек: антенна должна оставаться абсолютно сухой. Использование сапфира лезвие, вырезать отверстие в кутикулу. Во-первых, слегка оценка по кутикулярной раз непосредственно за антенну, а затем разрезать вдоль глаза и через глазки на спине. Наконец, сложить часть кутикулы по краю и забил вырезать из нижней, чтобы избежать разрыва усиков нервы. Осторожно снимите железы и трахеи с мелким пинцетом. Промыть раз с Drosophila </EM> Рингера, оставляя большую каплю на голове. 3. Доставка Запах Стимул Запах шприцов: вставить целлюлозы площадке в 2 мл шприц с чистым пинцетом и пипеткой на него (с помощью фильтра советов) 20 мкл запаха, разбавляется в соответствии с пожеланиями в соответствующем растворителе, с помощью пипетки, чтобы нажать на панели глубоко в ствол . Подключите и крышки шприца, пока требуется. Свежий запах разведения должны быть готовы по крайней мере, каждые 3 месяца (или чаще, по крайне нестабильной и / или часто используемые запахи), а также новые колодки должны быть готовы к запаху шприцы перед каждой сессии записи. Не используйте запах площадки для более чем в три стимуляции, так как запах концентрация может распасться. Заказные ольфактометра (рис. 2): основной поток воздуха (1 л / мин) направляется через трубку тефлон (0,4 мм внутреннего диаметра), 27 см перед выходом из этой трубы, вторичный поток воздуха (1 л / мин ) добавляется. Оба воздушных потоков, порожденных мембранные насосы иРасход регулируется с помощью двух независимых расходомеров. Воздушных потоков может быть увлажненной, проходя через воду в газ мытья бутылок, хотя следует проявлять осторожность, чтобы избежать чрезмерного увлажнения (т.е. более чем на ~ 60%). Вторичный воздушный поток направлен либо через шприц запах или пустой шприц: Шприцы связаны с потоком воздуха через иглу шприца (1,2 мм наружный диаметр) Пирсинг поршень. Трехходовой электромагнитный клапан управляется через блок клапанов управления (например, Гарвард VC6 аппарата) используется для переключения между чистым воздухом и запахом стимул. 4. В естественных изображений Мы описываем здесь визуализации с использованием прямой флуоресцентный микроскоп (например, вертикально фиксированные этап Zeiss Axio Examiner D1) оснащена 20-кратным воды цель (например, Zeiss W "План-Apochromat" 20x / 1,0 М27 DIC) (рис. 2). Для изображений с G-Camp (возбуждение / излучение: 488/509 нм), использование фильтра блока со следующими свойствами: 450-490 нм фильтра возбуждения, Дихроичных зеркала (T495LP) и 500-550 нм фильтра испускания (Chroma ET). Установите монтажный блок, содержащий муху под микроскопом. Установите выход ольфактометра примерно 0,5 см от антенны мухи. Нижняя цель пока он не коснется решение Рингера на голову мухи. Просматривая просмотра в условиях яркого освещения поля, положение подготовку так, чтобы отверстие в головной капсулы по центру и его границы находятся в фокусе. Переключение в режим дневного света и настроить фокус, пока не увидите меченых нейронов (видно из базальных зеленой флуоресценцией G-цАМФ). Точной фокусировки на клубочках интерес получения изображения с зарядовой связью (ПЗС) камеры (например, CoolSNAP-HQ2 Цифровая камера системы), установленной на микроскопе помощью соответствующего программного обеспечения приобретения (например, Metafluor) (рис. 3А). Закройте диафрагму на пути светового облучения ограничить возбуждение светом отображаемой области. Для записи запах вызывалдеятельность, установить скорость регистрации до 4 Гц и установить время экспозиции для получения флуоресценции значения в динамический диапазон камеры CCD, но не ниже 1000 (условных единицах), по крайней мере с 12-битным динамическим разрешением. Время экспозиции не должна превышать 100 мс, если это возможно, чтобы уменьшить G-Camp фотообесцвечивания. Если пространственное разрешение камеры позволяет, вы можете увеличить биннинга (количество скважин на чипе, который будет binned в один пиксель цифрового), чтобы уменьшить время экспозиции. Получены изображения 350×225 пикселей (с биннинга 2х2), соответствующие 210×135 мкм при подготовке. Эти параметры являются оптимальными для захвата клубочковой запах вызванных ответов G-лагерь с хорошим пространственным и временным разрешением, ограничивая при этом репортер отбеливания. Установите параметры измерения. Как правило, мы запись в течение 10 секунд (т.е. 40 кадров), с запахом стимуляции как правило, начиная через 4 секунды после начала периода сбора (кадр 15) и прочного одну секунду (иntil кадр 19). Муха подготовка обычно могут быть протестированы с до 25-30 различных раздражителей запахом, часто ограничивается необратимого снижения флуоресцентного сигнала корреспондента в связи с фотообесцвечивания. Между стимулом интервал будет зависеть от силы ответа наблюдается и скорость фотообесцвечивания. Соответствующая длина между стимулом интервал, чтобы избежать сенсорной адаптации может быть определена примерно повторяется презентации положительного запаха (если известно) в суд экспериментов. Включение этого запаха каждый ~ 10 стимулов в данной серии может позволить проверки жизнеспособность и последовательную реакцию на препарат. 5. Обработки и анализа данных Данные обработаны с помощью ImageJ (с Mac биофотоники плагин, www.macbiophotonics.ca ) и пользовательских программ написаны в Matlab и R следующим образом: Исправьте артефактов перемещения образца:выровнять все изображения соответствует одному животному препарат (например, 30 измерений 40 кадров каждая) с помощью «твердого тела» режиме StackReg / TurboReg ( bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg ) в ImageJ. Этот шаг необходим для удаления изменений в положение меченых нейронов в отношении приобретения кадров внутри и между измерениями. Тем не менее, это возможно только для удаления сдвиги в плоскости ху. Данные должны быть отброшены, если сильные изменения происходят в центре внимания. Сегмент стека в отдельный 10-секундный (40 кадра) измерений. Правильная для отбеливания артефактов: воздействие дневного света может привести к распаду флуоресценции во время одного измерения 10. В некоторых случаях, важно, чтобы исправить этого распада до анализа данных. Для каждого измерения расчета фона кадра. Это должно быть среднее несколько кадров до начала стимула (например, кадры 6-14). Разделите каждый кадр этой backgвокруг кадра для получения относительной флуоресценции изменения. Рассчитать среднее значение относительной флуоресценции для каждого кадра путем усреднения всех точек в зоне помечены G-Camp. Установить двойной экспоненциальной средней с кривой флуоресценции, давая сильный вес в рамках до стимула и нулевым весом от времени запах ответ (20 кадров после начала стимула в нашем случае). Вычтите оборудованная кривой от кривой относительной флуоресценции каждого пикселя. Умножьте исправлены кадров на фоне кадров для повторного получения исходных данных. Такая коррекция может привести к изменению в ответ динамику, если сигнал не возвращается к исходным к концу измерения (например, если тормозное или очень сильное возбуждающее ответы вызывали) (рис. 4). В то время как коррекция отбеливания артефакты полезно во многих случаях интерпретация временных параметров следует проводить с осторожностью, если отбеливатель коррекция применяется. Рассчитать относительное изменение флуоресценции (и деLTA, F / F) для каждого кадра, каждого измерения, (F я-F 0) / F 0 * 100, где F 0 фоне кадров (см. 5.3) и F я флуоресценции значение для я-го кадра измерения. Рассчитать среднюю f / F в круговой области интереса клубочек (рис. 3В) с диаметром 10 пикселей для получения следов активности (рис. 5а). При желании превратить эти следы в heatmaps использованием ImageJ (рис. 5а). Рассчитать амплитуду отклика путем вычитания среднего f / F из четырех кадров до раздражения от среднего f / F из четырех кадров в разгар реакции. Такая же процедура используется как для иллюстрации пространственного распределения ответов (см. Рисунок 3B) и количественно АЧХ в конкретных регионах, представляющих интерес через мух (см. рис 5B). Максимальную чувствительность может быть определена количественно путем интеграции площадь под кривой во время стимула, или averaginг рамки вокруг максимального отклика. 6. Представитель Результаты Мы использовали протоколы выше для записи и анализа пропионовой кислоты вызвало реакцию мух выражения G-CaMP1.6 28 под контролем промотора на обонятельные рецепторы со-IR8a, который принимает активное участие в различных популяциях OSNs 29,30 ( Цифры 3-5). Стимуляция с 1% пропионовой кислоты вызывает увеличение G-Camp флуоресценции – указывает увеличение внутриклеточного кальция – в OSNs иннервирующих два клубочков, DC4 и DP1l (рис. 3В). Проиллюстрируем различные способы представления данных из нескольких мух на рисунке 5: линии следов активности, heatmaps и бар участок пик ответов. Пропионовой кислоты вызывали ответы имеют различные амплитуды пика и временная динамика в DC4 и DP1l. Кроме того, хотя ответы, как правило, надежные, изменчивость между отдельными животными можно наблюдать как в клубочках (см. егоatmaps на рисунке 5А). Количественный пик ответов (рис. 5Б) позволяет простое статистическое сравнение между различными клубочков и различные отдушки через животных. Тем не менее, запах вызывал ответы кальция может быть неоднородным временную динамику, и количественно их величины с одним значением будет игнорировать эту сложность. Рисунок 1. Схема монтажного блока (A) до и (б) после введения лету, и (C) вид сверху крупным планом (адаптировано из 31). Рисунок 2. Схема экспериментальной установки. Рисунок 3. (А) Вид сверху лету подготовка после шага 2.8 (левая панель) и сырья флуоресценции образ ставкиnnal доли помечены G-CaMP1.6 (генотип: IR8a промоутер: GAL4; UAS: G-CaMP1.6). DC4 и DP1l клубочков можно отличить по их морфологии, размеров и положения и отмечены красным и синим соответственно. (B) с цветовой кодировкой изображения ответ на пропионовой кислоты (1% объем / объем). Изображение соответствует f / F пика отклика рассчитывается как описано в пункте 5.6 (см. также рис 5А). Colorscale слева указывает на% f / F значение. Черные круги указывают положение и размер области интереса используется для количественной оценки ответов (см. Рисунок 5). Рисунок 4. Исправление отбеливания флуоресцентного сигнала репортера. Примеры эффект отбеливания коррекцию, как описано в пункте 5.3. Пример данных на левой панели можно исправить без серьезных изменений в форме ответа. Пример данных на правой панели сильно влияет наред по отбеливатель коррекция, скорее всего, потому что сигнал падает и сохраняется ниже базового уровня после окончания стимула запах. Рисунок 5 (А) Начало:. Временной динамики кальций ответы клубочков DC4 (слева) и DP1l (справа) пропионовой кислоты (1% объем / объем). Черные следы показывают средний среднего f / F в интересующей нас области (см. рис 3B) в восьми животных. Серая поверхность указывает на диапазон между первой и третьей квартили распределения. Презентация и средний квартиль значения предоставляет больше информации об изменчивости и распределения наблюдаемых откликов, чем средние и стандартные ошибки. Зеленый и пурпурный коробках показывают кадры среднем рассчитать пик ответов показано на рисунке 3b, и количественно на рисунке 5B. Внизу: heatmaps показывают данные ответа для всех отдельных животных в отдельных строках, при f / F значения Represented по colorscale (крайний справа). Горизонтальные черные полосы указывают время и длительность стимула. (B) Средний пик ответы на пропионовой кислоты в восьми животных DC4 и DP1l клубочков. Ошибка полоски показывают диапазон между первой и третьей квартили распределения.

Discussion

Подготовка и анализ методов, описанных здесь, могут быть использованы для анализа запахов вызывало ответы в любой популяции нейронов в усиков доли (OSNs Л.Н., векселя), для которых соответствующие трансгенов драйвер. В то время как мы описываем свои приложения с помощью флуоресцентного микроскопа, оптического изображения этого препарата в равной степени могут быть выполнены с помощью конфокальной и двухфотонной микроскопии ^22,32. Действительно, эти последние документы облегчить рассеяния света проблема широкого поля микроскопии, которая может уменьшить разрешение изображения, особенно при большом количестве нейронов экспресс-репортер. Этот препарат обычно позволяет записей запах вызывал ответы, по крайней мере полчаса, но на этот раз может быть значительно больше или меньше в зависимости от количества и продолжительности измерений регистрируются, время экспозиции для каждого кадра и между стимулом интервала. Кроме того, двухфотонного возбуждения может уменьшить фотообесцвечивания флуоресцентного репутацияorter, а также сотовые фототоксичности, чтобы позволить измерения в течение длительных периодов времени ^22,32.

Независимо от выбора микроскоп, движение лету мозга в головной капсулы является наиболее актуальной проблемой, когда изображение в интактных животных. В то время как движение коррекция может исправить незначительные проблемы (шаг 5.1), как правило, лучше только для записи с высокой стабильностью препаратов. Стратегии сокращения движение артефакты включают в себя: (I), надлежащим образом ограничивает хоботок мухи с позвоночником кактус, (II) иммобилизации ноги мухи, фиксируя их на сцену с эйкозана (до шаг 2.6) (эйкозана можно расплавить при температуре ~ 37 ° C, использование серебряной проволоки, чтобы расширить и уточнить кончике паяльника для этой цели), (III), уменьшение поперечного сечения пищевода (видимые между усиков нервов) с тонкой пинцетом.

В дополнение к G-CaMP1.6 здесь используется целый ряд оптимизированных версий G-цАМФ и другие показатели кальция имеются,которые отличаются по своему сигнал-шум, базовые флуоресценции и временная динамика ^12,28,33. Точный выбор датчиков необходимо учитывать все эти свойства, тип нейронов, которые будут проанализированы и биологические вопросы решаются. Датчики тока сообщают кальция изменения, которые коррелируют с достаточно хорошо потенциалы действия ^12,34, и их дальнейшее совершенствование, в сочетании с увеличением числа специфических генетических линий водитель ³⁵ будет и впредь укреплять потенциал оптических изображений нейронной активности в интактной лету.

Materials

Reagent	Supplier	Catalogue number	Comments
Cactus spine	Garden center		~7mm long thin, not too flexible
Rosin	String instrument shop
Two component silicon	WPI	KWIK-SIL
Custom made plexiglass mounting block	Blueprints available from http://neuro.uni-konstanz.de/jove_mountingblock_blueprint/
Copper grids	Athene Grids	G220-5	Normally used for electron microscopy samples.
Screws	Hardware store		2 mm diameter
Plastic coverslips	Plano-em	L4193	22 X 22 mm
Soldering iron tips	Conrad Electronics	830283-62
Regulated power supply	Conrad Electronics	511407-62
Thin wire	Isabellenhütte	Isa-ohm	0.013 mm
Eicosane	Sigma	21,927-4
Microscope	Zeiss	Axioexaminer D1
CCD camera	Visitron	CoolSnap HQ
Metafluor	Visitron		Acquisition software
Monochromator	Visitron	Visichrome
Breakable blades	Fine Science Tools	10050-00
Holder for blade	WPI	14134
Sapphire blade	WPI	500314	Double edged blade 1mm
Membrane gas pumps	KNF Neuberger AG	NMP 830 KVE
Sapphire blade holder	WPI	500317
Three way valve	Lee Company	LFAA1200118H	Configuration E
Rotameter 500 ml/min	Analyt-MTC	112-08SA
Rotameter 5 L/min	Analyt-MTC	102-08SA
Beeswax	Siladent Technik	209212
Cellulose pad	Kettenbach Medical	31003
Tweezers	Plano-em	T5130	Dumont biology #5
Syringes	BD	300928	2ml, Discardit II, 2pieces
Needles	Braun Sterican	4665120	1.2mm OD