1. Montering Block Assembly Den plexiglass montering blokk (figur 1A) bør gjøres til de nøyaktige spesifikasjonene i blåkopi (tilgjengelig fra http://neuro.uni-konstanz.de/j ove_mountingblock_blueprint / ) For å tillate enkel montering og disseksjon av flua. Tråden gjennom skruene fra baksiden, men ikke utvide dem utover foran blokka, deres posisjon vil bli justert under forberedelsen av dyret (se 2.7). Ved hjelp av en presisjon drill, lage en bulk i den øvre grensen av det runde kammeret for flua, grave under overflaten for å gjøre plass til flua kropp, redusere tykkelsen på blokken på dette punktet. Skjær en kobber rutenett med en skalpell vinkelrett og nær bunnen av sprekken for å lage en "krage". Pass på de to resulterende flaps er nivå, da dette vil bidra til innsetting av flua. Med en tannpirker, plasserer en liten dråpe superlim på montering blokken over sirkulær kammeret for flua. Plasser kobber rutenettet på lim og posisjon slik at sprekken er sentrert på blokken (figur 1A). Trykk forsiktig ned og fjerne overflødig lim. Med en pinsett, legge små dråper lim under klaffer på hver side og brett rutenett over fronten av blokken slik at splitten peker rett nedover. Pass på toppen av rutenettet er på nivå med blokken. La det tørke helt. Sett sammen en wire holder: klippe en plast dekkglass i to og fjerne en sentral brikke for å lage en "U"-form. Bruk bivoks å lime et stykke ledning over toppen av "U", gjør ikke ledningen altfor stram. Konstruer antennal skjold: lage et hull i en plastpose dekkglass med en papir hulling. Trim kantene på dekkglass til 0,5 x 0,7 cm. Lim gjennomboret plast dekkglass å tape, og deretter plassere en dråpe av etanol på tapen eksponert gjennom hullet tilfjerne limet. 2. Animal Forberedelse Fluer riktig genotype – dvs. bærer ønsket kombinasjon av "driver" og aktivitet-reporter transgener – bør være 1-3 uker gammel, skjellaget av yngre fluer er for myk og vanskelig å skjære. Når eksperimentene krever direkte sammenligning av ulike genotyper, og for å matche transgenet uttrykk nivåer, bør fluene være alders-matchet å unngå aldersrelaterte fysiologiske forskjeller. Hvis kjønn ikke er viktig, foretrekker vi å bruke kvinnelige fluer siden de har større hoder og er lettere å manipulere. Anesthetize fluer ved nedkjøling på is. Innføre en enkel flue i montering blokken. Hold flua ved vingen felles og skyv det, dorsal overflaten først, langs splitten i kobber nettet slik at den blir suspendert av sin hals (Figur 1B-C). Hvis nødvendig, roter det til det ser ned. Plasser en fin kaktus ryggraden foran fly hode for å hindre at den rømmer (Figur 1B-C). Plasser kaktus ryggraden foran snabel for å hindre den fra å flytte. Fest kaktus ryggraden til blokken ved hjelp av bivoks. Pass på at toppen av hodet er på nivå med toppen av blokken. Fest hodet på flua til blokken med en liten dråpe rosin (oppløst i etanol). Plasser blokken i en fuktet boks og la harpiks for å herde i ca en time. Ved hjelp av tang, dra antennal platen frem og slippe ledningen på holderen (voks-side ut, se 1.5) i cuticular fold mellom antennen og hode. Fest holderen til forsiden av blokken med bivoks. Bruk skruene innebygd i blokken, skyv ledningen innehaver frem til å lage litt plass mellom antennal plate og hodet. Plasser antennal skjold (se 1.6) over toppen av flua hode med hullet plassert sentralt. Fest med bivoks til toppen av montering blokken. Ved hjelp av en kniv-splitter, CuTA lite hull i tapen på skjoldet utsette skjellaget på flua hode bak antennen. Hullet bør ikke strekke seg utover øynene for å forhindre forberedelsen lekker. Tett hullet mellom tape og skjellaget med to-komponent silisium. Fjern overflødig silisium fra toppen av flua hode. Plasser en dråpe Drosophila Ringer saltvannsoppløsning (130 mM NaCl, 5 mm KCl, 2 mM MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 36 mm sakkarose, 5 mm HEPES, pH 7,3) på hodet. Kontroller at det ikke er noen lekkasjer: antennene bør forbli helt tørt. Ved hjelp av en safir blad, skar et hull i skjellaget. Først lett poengsummen langs cuticular fold rett bak antennen, og deretter klippe langs øynene og over Ocelli på baksiden. Til slutt, brett stykke skjellaget over scoret kanten og skjære fra undersiden for å unngå kutte de antennal nervene. Fjern forsiktig kjertler og luftrør med fine pinsett. Skyll gjentatte ganger med Drosophila </em> Ringer, etterlot seg en stor dråpe på hodet. 3. Lukt Stimulus Levering Lukt sprøyter: Sett en cellulose pute i en 2 ml plastsprøyte med rene pinsett og pipette på det (ved hjelp av filter tips) 20 mL av lukt, utvannet som ønsket i en passende løsemiddel, ved hjelp av pipettespissen å skyve puten dypt inn i tønne . Plugg og lue sprøyten inntil nødvendig. Frisk lukt fortynninger bør utarbeides minst hver 3. måned (eller oftere for svært flyktige og / eller ofte-brukt lukt), og nye puter bør være forberedt på lukt sprøyter rett før hvert opptak. Ikke bruk lukt pads for mer enn tre stimuleringer, ettersom lukt konsentrasjonen kunne forfalle. Custom-made olfactometer (figur 2): en primær luftstrømmen (1 l / min) er rettet gjennom Teflon tubing (0,4 mm innvendig diameter); 27 cm oppstrøms utløpet av dette røret, en sekundær luftstrømmen (1 l / min ) er lagt til. Begge luftstrømmer genereres av membran pumper, ogstrømningshastigheten er regulert av to uavhengige strømningsmålere. De luftstrømmer kan være fuktet ved å passere gjennom vann i gass vaske flasker, men forsiktighet bør utvises for å unngå over-luftfukting (dvs. mer enn ~ 60%). Den sekundære luftstrømmen er rettet enten gjennom en lukt sprøyte eller en tom sprøyte: sprøyter er koblet til luftstrømmen gjennom en kanyle (1,2 mm ytre diameter) piercing stempelet. En tre-veis magnetventil styres via en ventil kontrollerenhet (f.eks Harvard Apparater VC6) brukes til å veksle mellom ren luft og lukt stimulans. 4. In vivo avbildning Vi beskriver her bildebehandling ved hjelp av en oppreist fluorescerende mikroskop (f.eks stående fast Stage Zeiss Axio Kontrol D1) utstyrt med en 20x vann objektiv (f.eks Zeiss W "Plan-Apochromat" 20x / 1,0 M27 DIC) (figur 2). For bildebehandling med G-camp (eksitasjon / utslipp: 488/509 nm), bruke et filter blokk med følgende egenskaper: 450-490 nm eksitasjon filter, Dichroic speil (T495LP) og 500-550 nm utslipp filter (Chroma ET). Plasser montering blokken inneholder flua under mikroskopet. Plasser avkjørselen til olfactometer ca 0,5 cm i fronten på flua i antennene. Senk målet til den berører Ringers løsning på direkten hode. Ser gjennom visningen under lyse-feltet belysning, plassering forberedelsene slik at hullet i hodet kapselen er sentrert og dens grenser er i fokus. Bytt til fluorescerende lys og justere fokus til du kan se de merkede nevroner (tilsynelatende fra basal grønn fluorescens av G-camp). Fin fokus på glomeruli av interesse ved å kjøpe bilder med en Charge-coupled device (CCD) kamera (f.eks CoolSNAP-HQ2 Digital Camera System) montert på mikroskopet ved hjelp av egnet kjøp programvare (f.eks Metafluor) (figur 3A). Lukk membranen i belysning lysbanen å begrense magnetisering lys til avbildes området. For opptak lukt-genererteaktivitet, setter oppkjøpet satsen til 4 Hz og justere eksponeringen tid til å skaffe fluorescens verdier innenfor den dynamiske rekkevidden av CCD kamera, men ikke lavere enn 1000 (vilkårlige enheter), med minst 12-bits dynamisk oppløsning. Eksponeringstiden bør ikke overskride 100 ms, om mulig, å redusere G-camp fotobleking. Dersom romlig oppløsning på kameraet ditt tillater det, kan du øke Binning (antall brønner på brikken som skal binned til en digital piksel) for å redusere eksponeringen tid. Vi får bilder av 350×225 piksler (med en Binning av 2×2), tilsvarende 210×135 mikrometer ved forberedelse. Disse innstillingene er optimalt å fange glomerulære lukt-induserte reaksjoner fra G-camp med god romlig og tidsmessig oppløsning samtidig som den begrenser reporter bleking. Still måleparametere. Vi vanligvis opp i 10 sekunder (dvs. 40 rammer), med lukt stimulering vanligvis starter 4 sekunder etter begynnelsen av oppkjøpet perioden (ramme 15) og varig en andre (until ramme 19). En flue forberedelse kan normalt testes med opptil 25-30 forskjellige lukt stimuli, ofte begrenset av en irreversibel nedgang i fluorescerende signal om reporteren grunn photobleaching. Den inter-stimulus intervall vil avhenge av styrken av responsen observert og hastigheten av photobleaching. Den passende lengde inter-stimulus intervall for å unngå sensorisk tilpasning kan bestemmes omtrent ved gjentatt presentasjon av en positiv kontroll lukt (hvis kjent) i rettssaken eksperimenter. Inkludering av denne lukt hvert ~ 10 stimuli i en gitt serie kan tillate verifisering av fortsatt levedyktighet og konsistent respons av preparatet. 5. Data Processing og analyse Data behandlet ved hjelp ImageJ (med Mac Biophotonics plug-in, www.macbiophotonics.ca ) og egendefinerte skriftlige programmer i Matlab og R som følger: Rett etter prøven bevegelse gjenstander:justere alle bildene tilsvarer en dyr forberedelser (f.eks 30 mål på 40 rammer hver) med "stive kroppen" modus av StackReg / TurboReg ( bigwww.epfl.ch / thevenaz / stackreg ) i ImageJ. Dette trinnet er nødvendig for å fjerne skift i plasseringen av merket nevroner med hensyn til anskaffelse rammen innenfor og mellom målingene. Det er imidlertid bare mulig å fjerne skift i xy planet. Data skal kastes dersom sterke endringer i fokus forekomme. Segment stabelen i individuelle 10-sekunders (40-ramme) målinger. Riktig for bleking gjenstander: Eksponering for fluorescerende lys vil føre til fluorescens å forfalle i løpet av en enkelt måling 10. I noen tilfeller er det viktig å korrigere for dette forfallet før analysere dataene. For hver måling kalkulere en bakgrunn ramme. Dette bør være gjennomsnittet av flere rammer før stimulus onset (f.eks rammer 6-14). Dele hver ramme av denne backgrunde ramme for å oppnå de relative fluorescens endringene. Beregn middelverdien relative fluorescens verdi for hver ramme ved gjennomsnitt alle piksler innenfor området merket med G-camp. Monter en dobbel eksponentiell til gjennomsnittet fluorescens kurve, noe som gir sterkere vekt på rammene før den stimulans og null vekt på tiden av lukt respons (20 bilder etter stimulans utbruddet i vårt tilfelle). Trekk det monterte kurven fra den relative fluorescens kurve for hver piksel. Multipliser de korrigerte rammer av bakgrunnen rammen til re-skaffe rådata. Denne typen korreksjon kan føre til en endring i responsen dynamikk hvis signalet ikke går tilbake til grunnlinjen innen utgangen av målingen (f.eks hvis hemmende eller veldig sterk eksitatoriske responser fremkalt) (figur 4). Mens korrigering av bleking artefakter er nyttig i mange tilfeller bør tolkning av verdslige parametere gjøres med forsiktighet hvis et blekemiddel korreksjon brukes. Beregn den relative endringen i fluorescens (& Delta; F / F) for hver ramme av hver måling som (F i-F 0) / F 0 * 100, hvor F 0 er bakgrunnen rammen (se 5.3), og F i fluorescens verdien for jeg th rammen av målingen. Beregn gjennomsnittlig ΔF / F innenfor et sirkulært område av interesse i en glomerulus (Figur 3B) med en diameter på 10 piksler for å skaffe aktivitet spor (Figur 5A). Hvis ønskelig, transformere disse sporene til heatmaps bruker ImageJ (Figur 5A). Beregn topp amplitude av responsen ved å trekke gjennomsnittet ΔF / F av fire bilder før stimulering fra den midlere ΔF / F av fire bilder i løpet av midten av responsen. Samme fremgangsmåte brukes både for å illustrere romlige reaksjonsmønstrene (se figur 3B) og å tallfeste responsen amplituden i bestemte regioner av interesse på tvers av fluer (se figur 5B). Toppen responsen kan også kvantifiseres ved å integrere arealet under kurven i den tiden av stimulus, eller averaging rammene rundt det maksimale av responsen. 6. Representative Resultater Vi brukte protokollene over for å registrere og analysere propionsyre-evoked responser fluer uttrykker G-CaMP1.6 28 under kontroll av arrangøren for olfactory co-reseptor IR8a, som er aktiv i flere forskjellige populasjoner av OSNs 29,30 ( Tall 3-5). Stimulering med 1% propionsyre utløser økning i G-camp fluorescens – indikerer en økning i intracellulær kalsium – i OSNs innervating to glomeruli, DC4 og DP1l (Figur 3B). Vi illustrerer ulike måter å representere data fra flere fluer i Figur 5: Linje aktivitet spor og heatmaps og en bar tomt av peak svar. Propionsyre-evoked responser har forskjellige peak amplituder og tidsmessige dynamikken i DC4 og DP1l. Dessuten, selv om svarene er generelt robuste, kan variasjon mellom individer også være observert i både glomeruli (se hanatmaps i Figur 5A). Kvantifisering av peak svar (Figur 5B) tillater en enkel statistisk sammenligning mellom ulike glomeruli og ulike odorants tvers dyr. Imidlertid kan luktfrie evoked kalsium svarene har ikke-uniform timelige dynamikk, og kvantifisering deres magnitude med en enkelt verdi vil se bort fra denne kompleksiteten. Figur 1. Skjematisk av montering blokk (A) før og (B) etter innføringen av flua, og (C) en topp utsikt i nærbilde (tilpasset fra 31). Figur 2. Skjematisk av den eksperimentelle oppsett. Figur 3. (A) Top visning av flua preparatet etter trinn 2.8 (venstre panel) og rå fluorescens bilde av antennal lobes merket med G-CaMP1.6 (Genotype: IR8a promoter: GAL4; UAS: G-CaMP1.6). DC4 og DP1l glomeruli kan være preget av deres morfologi, størrelse og posisjon og er merket i rødt og blått, henholdsvis. (B) Fargekodede bilde av responsen til propionsyre (1% v / v). Bildet tilsvarer ΔF / F for toppen av responsen beregnes som forklart i trinn 5.6 (se også figur 5A). Den colorscale på venstre angir% ΔF / F verdi. De svarte sirklene viser plasseringen og størrelsen på regionen av interesse brukes til å kvantifisere svarene (se figur 5). Figur 4. Korrigere bleking av fluorescerende reporter signal. Eksempler på effekten av blekemiddel korreksjon som beskrevet i trinn 5.3. Eksempeldata på venstre panel kan korrigeres uten store endringer i form av responsen. Eksempeldata på høyre panelet påvirke alvorliged av blekemiddel korreksjon, sannsynligvis fordi signalet synker og blir vedlikeholdt under grunnlinjen etter lukt stimulans avslutning. Figur 5 (A) Topp:. Timelige dynamikk av kalsium svarene av glomeruli DC4 (til venstre) og DP1l (høyre) til propionsyre (1% v / v). De svarte sporene viser medianen av middelverdien ΔF / F innenfor regionen av interesse (se Figur 3B) over åtte dyr. Den grå flaten viser området mellom første og tredje kvartiler av distribusjonen. Presentasjon av median og kvartil verdier gir mer informasjon om variabilitet og distribusjon av observerte responser enn gjennomsnittet og standardavviket. De grønne og magenta boksene indikerer rammene i gjennomsnitt til å beregne topper svarene som er vist i Figur 3B, og kvantifisert i figur 5B. Nederst: heatmaps viser svardatene for alle individuelle dyr i separate rader, med ΔF / F verdier Represented av colorscale (helt til høyre). De horisontale svarte striper angir tidspunkt og varighet av stimulans. (B) Median for maksimal respons på propionsyre over åtte dyr for DC4 og DP1l glomeruli. De feilfelt viser området mellom første og tredje kvartiler av distribusjonen.