De toepassing van permanente midden cerebrale slagader Ligatie in de muis

Summary

Midden cerebrale arterie (MCA) ligatie is een techniek om focale cerebrale ischemie studie in diermodellen. In deze methode wordt de middelste hersenslagader blootgesteld door craniotomie en geligeerd door cauterisatie. Deze methode geeft zeer reproduceerbare infarct volumes en hogere post-operatieve overlevingskansen in vergelijking met andere methoden beschikbaar.

Abstract

Focale cerebrale ischemie is een van de meest voorkomende vorm van beroerte bij patiënten. Vanwege de klinische betekenis is er een langdurige inspanning van geschikte diermodellen ontwikkelen om de gebeurtenissen die zich ontvouwen tijdens de ischemische belediging studie. Deze technieken zijn tijdelijk of blijvend zijn, focale of globale ischemie modellen met behulp van vele verschillende diermodellen, met de meest voorkomende zijn knaagdieren.

De permanente MCA ligatie methode die ook als pMCAo genoemd in de literatuur wordt veelvuldig gebruikt als een focale ischemie model in knaagdieren ^1-6. Deze methode werd oorspronkelijk beschreven voor ratten door Tamura et al.. in 1981 ^7. In dit protocol een craniotomie werd gebruikt om toegang tot het MCA en het proximale regio's werden afgesloten door elektrocoagulatie. De infarcten betrekken vooral corticale en soms striatum regio's afhankelijk van de locatie van de occlusie. Deze techniek is nu goed ingeburgerd en wordt gebruikt in veel laboratoria ^8-13. Vroeg gebruik van deze techniek heeft geleid tot de definitie en beschrijving van "infarct kern" en "penumbra" ^14-16, en het is vaak gebruikt om potentiële neuroprotectieve verbindingen ^{10, 12, 13, 17} te evalueren. Hoewel de eerste studies werden uitgevoerd bij ratten, heeft een permanente MCA ligatie met succes toegepast bij muizen met kleine wijzigingen ^18-20.

Dit model levert reproduceerbare infarcten en een grotere post-overleving. Ongeveer 80% van de ischemische beroerte bij mensen gebeuren in het MCA gebied ²¹ en dus is dit een zeer relevant model voor een beroerte studies. Momenteel is er een gebrek aan effectieve behandelingen beschikbaar voor patiënten met een beroerte, en daarom is er een behoefte aan goede modellen om potentiële farmacologische verbindingen te testen en evalueren van fysiologische resultaten. Deze methode kan ook gebruikt worden voor het bestuderen van intracellulaire hypoxie mechanismen voor een respons in vivo.

Hier presenteren we de MCA ligatie chirurgie in een C57/BL6 muis. Beschrijven we de pre-operatieve voorbereiding, MCA ligatie chirurgie en 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) kleuring voor de kwantificering van infarct volumes.

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Rochester commissie gewijd aan de ethische gebruik van dieren in het onderzoek (UCAR). Aseptische technieken moeten gevolgd worden tijdens het protocol. Het gebruik van steriele handschoenen en een masker is vereist.

Alle apparatuur, materialen, chemicaliën, en tools die gebruikt worden tijdens het protocol worden beschreven in Tabel 1.

1. Pre-operatieve voorbereiding

1. Subcutaan injecteren muizen met buprenorfine (0.05mg/kg) 2 uur voor de operatie, direct na de operatie en daarna elke 3-5 uur gedurende de eerste 24 uur post-operatieve periode.
2. Steriliseer alle chirurgische instrumenten, gazen sponzen, en katoen tip applicators door autoclaaf. Houden chirurgische instrumenten in 70% ethanol tijdens de operatie en de lucht droog steriel gaasje rechts voor gebruik. Spray het werkgebied met 70% ethanol.
3. Verdoven van de muis met een 3% isofluorane-20% zuurstof gasmengsel met behulp van een verdoving vaporizer. Pas de hoeveelheid zuurstof met de stroom meter. Test het niveau van de verdoving door de teen of staart knijpen (ze moeten reageren). Op peil houden van de anesthesie met 2% (v / v) isofluorane.
4. Pas kunstmatige tranen in de ogen van de muis en ga er voorzichtig om te voorkomen dat schade aan het oog tijdens de chirurgische ingreep. Plaats de muis op zijn rechterkant in een laterale positie.
5. Scheer het gebied aan de linkerkant tussen het linkeroog en de basis van het linker oor met behulp van het dier tondeuse. Reinig het gebied met afwisselend een Betadine-oplossing en 70% ethanol met behulp van wattenstaafje applicators en licht wrijven het gebied. Herhalen als nodig is.
6. Plaats de muis op een verwarmingselement aangesloten op een rectale sonde naar de lichaamstemperatuur te handhaven op 37 ° C. Plaats de rectale probe door gebruik van minerale olie.
7. Plaats de muis op de rechterkant onder de loep en zet met tape. Snij een venster in een gaas spons en bedek chirurgisch gebied.

2. Chirurgische ingreep en MCA Ligatie

1. Maak een verticale incisie tussen het linkeroog en de basis van het linker oor met behulp van fijne rechte schaar. Gebruik gebogen hemostats te houden van de chirurgische te openen.
2. Maak een horizontale incisie op de temporale spier met behulp van het voorjaar een schaar en een beetje de temporale spier te scheiden van de schedel door langzaam te trekken met een pincet.
3. Maak een kleine subtemporal craniotomie op de kruising van jukbeenboog en squamosal bot met behulp van een 18G naald terwijl het kaakbot met gebogen tang.
4. Expose het MCA door het verwijderen van de kleine stukjes van de schedel met botten rongeurs. De jukbeenboog en orbitale de inhoud mag niet worden beschadigd tijdens dit proces. Als er te veel drogen van weefsels optreedt tijdens dit proces toe te passen steriel PBS met katoen tip applicators.
5. Afbinden het distale gedeelte van de MCA met behulp van een klein vaartuig cauterizer.
6. Plaats de temporale spier in zijn oorspronkelijke positie en sluit de incisie met chirurgische 5-0 nylon hechtingen.
7. Stop met verdoving en verwijder de rectale sonde. Injecteer de muis met een 2e dosis van buprenorfine (0.05mg/kg) subcutaan. Zet de muis naar de kooi, die werd gehouden bij 37 ° C met een verwarmings-panel.
8. Nauwlettend toezien op de muis voor de komende 24 uur voor enig ongemak (verminderde eetlust / water verbruik, gebogen houding, verhoogde ademhaling, pilo-opgericht haar). Injecteer de muis met buprenorfine subcutaan elke 3-5 uur na de operatie tot 24 uur. Geef de muis met recovery gel in deze periode.

3. TTC kleuring en bepaling van het slagvolume

1. Vierentwintig uur na de operatie diep de muis verdoven, transcardially perfuseren de muis met een 4% TTC (w / v) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 15 min en dan met een 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende 10 minuten met behulp van een mini-peristaltische pomp op medium debiet. Verwijder de hersenen en plaats deze in de 4% paraformaldehyde-oplossing 's nachts.
2. Plaats de hersenen in het snijden blok. Snijd de hersenen in 1mm dikke plakken met behulp van scheermesjes.
3. Leg de plakjes naast een millimeter schaal heerser. Foto van de plakjes met behulp van een digitale camera is aangesloten op het ontleden microscoop.
4. Bereken de slag gebied door aftrek van de niet-infarct gebied van de ipsilaterale site van de totale oppervlakte van de contralaterale site met behulp van Image J Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Bereken het slagvolume door het stapelen van de slag gebied van de plakjes ^22.

4. Routebeschrijving naar Image J software te gebruiken

1. Open het image-bestand te analyseren in Image J software door te klikken op het bestand menu.
2. Klik op de tab 'rechte lijn' in het programma. Trek een rechte lijn tussen de twee marges op de liniaal. Klik op 'analyseren' menu en selecteer 'set schaal'. Stel de bekende afstand als een, eenheid van lengte in mm.
3. Klik op de tab 'freehand circle'. Teken een cirkel om de contralaterale hemisfeer te schetsen. Klik op 'analyseren' menu en selecteer 'meten'. De berekening venster zal verschijnen met de oppervlakte van de cirkel getrokken.
4. Teken een cirkel rond de ipsilaterale hemisfeer met uitzondering van slag (wit) gebied. Meet het gebied zoals aangegeven in stap 4.3. De nieuwe waarde wordt toegevoegd aan de berekening venster. Het verschil tussen de 1e en 2e waarden vertegenwoordigt het gebied van het infarct, die wordt aangeduid als A in de onderstaande formule.
5. Bereken de slag gebied in elk plakje door het herhalen van de stappen 4,2-4,4. Neem sommatie van de beroerte oppervlakte die wordt berekend in elk plakje (ΣA _n). Dit vertegenwoordigt slagvolume het kennen van de feit dat de dikte van elk segment is 1mm.
   ΣA _n x 1mm (dikte van elk segment) = Het slagvolume

5. Representatieve resultaten:

De infarcten verkregen door permanente MCA ligatie in de muis zijn meestal corticale. Het is echter mogelijk om subcorticale letsels te verkrijgen als de MCA wordt geligeerd proximaal van de lenticulostriate tak. De slag volumes na MCA ligatie kan variëren van 10mm tot 35mm ³ ³ ^{19, 23.} De slag volumes berekend met TTC kleuring in Moyanova et al.. ¹⁹ zijn tussen de 10mm ³ tot 22 mm ³, terwijl de slag volumes bepaald op basis van MRI-beelden in Filiano et al. ²³ zijn tussen 20 mm ³ tot 35 mm ³. De mogelijke reden voor deze verschillen misschien wel de exacte locatie van de ligatie en de verschillende methoden gebruikt om de slag volumes te meten.

In figuur 1 is een TTC-lood hersenen 24 uur na de permanente MCA ligatie in een wild-type muis C57/BL6 getoond. De slag site is wit uiterlijk (Fig. 1A, B). Figuur 1A en B illustreren het infarct plaats vanuit verschillende invalshoeken. Figuur 2 toont 1mm dikke plakken van de TTC-lood slag hersenen van anterior naar posterior (fig. 2A-G). Infarct volume werd berekend 24 uur na de operatie. Het volume van het infarct is ~ 23mm ³.

Figuur 1. Vertegenwoordiging van een beroerte site. AB, TTC hele brein beelden, 24 uur in lood na MCA ligatie. Wit gebied vertegenwoordigt het infarct.

Figuur 2. Representatieve resultaten. (A> G), TTC gekleurde 1mm hersenen secties, 24 uur na MCal. Slices zijn uitgelijnd van anterior naar posterior. Wit gebied vertegenwoordigt het infarct.

Discussion

De permanente MCA ligatie methode geeft zeer reproduceerbare infarct volumes en hogere post-operatieve overlevingskansen in vergelijking met andere methoden beschikbaar. Het gemak en de korte duur (~ 30 min.) van de procedure maakt het nog praktischer. De methode wordt veel gebruikt in zowel muizen en ratten.

Deze techniek vereist een invasieve chirurgie onder een stereomicroscoop. Daarom is ervaring met het opereren onder een microscoop en het perfectioneren van een succesvolle craniotomie is essentieel. Het beste is om consistent infarcten vestigen in het lab voor experimenten worden uitgevoerd. Te bereiken reproduceerbare resultaten is het belangrijk om de MCA ligeren op dezelfde exacte locatie per keer. De MCA moet worden geligeerd proximaal van takken lenticulostriate als subcorticale infarcten gewenst zijn. De slagader is volledig geligeerd en de occlusie is permanent. Daarom is dit model niet mogelijk reperfusie via het MCA. Hoewel niet opgenomen in deze demonstratie, is het het beste als er een doppler probe wordt gebruikt voor het meten van de bloedstroom in het getroffen gebied te voltooien ligatie van de slagader te verifiëren.

De exploitant moet heel voorzichtig zijn niet te beschadigen of te doorboren, terwijl het blootstellen van MCA en coaguleren de slagader. Craniotomie moet worden uitgevoerd met uitgebreide zorg om schade aan het jukspier bot te voorkomen. Omdat de chirurgische gebied is zeer dicht bij het infarct gebied, moet schade aan de corticale oppervlak worden vermeden tijdens de craniotomie of cauterisatie. FST 18015-00 cateurizer eenheid of een bipolaire cateurizer kan worden gebruikt in plaats van de FST 18000-00 die in deze demonstratie. FST 18015-00 kan de gebruiker de temperatuur van de cauterizer tip aan te passen aan een laag vuur, die schade aan de corticale weefsel zou kunnen voorkomen. FST 18015-00 voorkomt ook de temperatuur schommelingen te zien in batterijen cauterisatie tools. Tijdens de cauterisatie, moet de gebruiker heel voorzichtig zijn om de cauterizer te houden van de zuurstoftoevoer en kan tijdelijk afsluiten van de O ₂ / isofluorane om het risico van ontsteking vermijden. Dit zal geen invloed hebben op de narcose toestand van de muis. Om te voorkomen dat dit risico, gebruiken we een ventilatiepijp uitgebreid tot de chirurgische gebied dat de luchtcirculatie voldoende is verhoogd, evenals trekt het overtollige O ₂ / isofluorane in de lucht.

De permanente MCA ligatie model is uiterst nuttig in het bestuderen van ischemische beroerte. Het kan gebruikt worden om neuroprotectieve test of studie moleculaire mechanismen van ischemie in vivo op transgene muis modellen. De voor de hand liggende voordeel voor het gebruik van deze in vivo benadering is dat dit zorgt voor de studie van de ischemische belediging op intacte neuronale netwerken en de gedragsmatige respons na belediging, in aanvulling op de neuro-inflammatoire processen die aanwezig zijn na de ischemische schade. Daarom heeft dit in vivo slag model biedt een kritische complementaire aanpak om in situ modellen die gebruikt worden om ischemie na te bootsen in celcultuur.