Summary
Анализ трубки образование используется для оценки сосудистой активности опухолевых клеток.
Abstract
За последние несколько десятилетий, анализ трубки формирование использованием фактора роста снижается Матригель был обычно используются для демонстрации ангиогенных деятельности сосудистых эндотелиальных клеток в пробирке 1-5. Однако в последнее время все больше доказательств показал, что этот анализ не ограничивается тест сосудистой поведение для эндотелиальных клеток. Вместо этого, он также был использован для тестирования способности количество опухолевых клеток развивать сосудистой фенотипа 6-8. Эта возможность была в соответствии с их vasculogenic поведения, определенные в xenotransplanted животных, процесс, известный как vasculogenic мимикрии (VM) 9. Существует множество доказательств, свидетельствующих о том, что опухоли клеточный В. М. играет жизненно важную роль в развитии опухоли, независимо от ангиогенеза эндотелиальные ячейки 6, 10-13. Например, опухолевые клетки были обнаружены на участие в крови перфузии, сосудистые образования канала в образцах тканей от меланомы и глиобластомы пациентов 8, 10, 11. Здесь мы описали это трубчатые анализа сети в качестве полезного инструмента в оценке vasculogenic активности опухолевых клеток. Мы обнаружили, что некоторые линии опухолевых клеток, таких как меланома B16F1 клеток глиобластомы U87 клеток, и рак молочной железы MDA-MB-435 клетки способны образовывать сосудистой канальцев, но некоторые не такие, как рак толстой кишки HCT116 клеток. Кроме того, это сосудистые фенотип зависит от числа клеток высевали на Матригель. Таким образом, этот анализ может служить мощная утилита для скрининга сосудистых потенциал различных типов клеток, включая клетки сосудистых, опухолевых клеток, а также другие клетки.
Protocol
1. Матригель основе труб Формирование Пробирной для оценки Vasculogenic активность опухоли
- Подготовка опухолевые клетки и клетки эндотелия капилляров: опухоль головного мозга клетки, такие как U87 клеток, клетки меланомы B16F1, рак молочной железы MDA-MB-435 и толстой кишки клетки HCT116 выращивали в DMEM с добавлением 10% ЭТС и пенициллина / стрептомицина (все из Invitrogen ). Эндотелиальная клеточной линии человеческих клеток эндотелия капилляров (HMVECs) культивировали в EBM2 среды (Lonza) с добавлением 1 мкг / мл гидрокортизона и 1 нг / мл эпидермального фактора роста, 10% ЭТС и пенициллина / стрептомицина. Клетки промывали PBS в три раза и апартаменты с 0,05% трипсин / ЭДТА (Invitrogen). После центрифугирования при 2000 оборотов в минуту в течение 5 мин, сотовые гранулы промывали снова с PBS. Затем осаждали клетки подсчитывали с гемоцитометра.
- Матригель подготовки: аликвоту фактор роста снижается Матригель (BD Bioscience) нагревали до комнатной температуры. Прежде чем полностью оттаять, оно было передано на лед и жидкий находился на льду в течение не менее 10 мин. Затем 50 мкл Матригель высевали в 96-луночных на горизонтальном уровне, что позволяет Матригель распространять равномерно, и инкубировали 30 мин при 37 ° C.
- Труба образование: Ячейки (1-2 х 10 4) были вновь приостановлены с бессывороточной DMEM для опухолевых клеток или ДМ-2 для эндотелиальных клеток, и загружены на вершине Матригель. Если этого анализа был использован для измерения воздействия некоторых агентов на трубочку развития, эти средства (стимуляторы или ингибиторы) были добавлены к бессывороточной среды. Каждая условная группа, содержащаяся 4-6 скважин.
- Изображение и анализ данных: После инкубации при температуре 37 ° С в течение ночи, каждый также был проанализирован непосредственно под микроскопом. Если канальцы были необходимы для фиксации, 100 мкл 10%-ного формалина солевой решение на базе мягко добавил и десять минут спустя, он был готов для анализа. Под микроскопом с 10-кратным фазового контраста, канальцы в каждой области были обследованы и в среднем от 3-5 канальцев случайных полей в каждой лунке подсчитывали.
2. Представитель Результаты:
HMVECs были использованы в качестве положительного контроля, так как эти канальцы были разработаны на основе ясно удлиненных тел ячейки, которые подключаются к форме многоугольника сети. B16F1, U87, и MDA-MB-435 разработан клетки сосудистой трубочки, аналогичные образована HMVECs, но HCT116 клетки не (рис. 1). Клетка дозозависимое трубки образование было испытано в U87 клеток. Как показано на рисунке 2, 10000 ячеек, образованных прекращено канальцев. Как только клетки в два раза, твердых сосудистая сеть была сопоставима с тем, которые наблюдаются в HMVECs. В противоположность этому, клетки менее 5000 не смогли сформировать сосудистой фенотипа.
Рисунок 1. Труба образованию индуцированных HMVECs, U87, MDA-MB-435, а B16F1 клеток, но не HCT116 клеток. Все клетки (2 х 10 4) были погружены на Матригель и инкубировали в течение ночи. Трубочки были обследованы использованием фазового контраста. HMVECs были использованы в качестве положительного контроля. Представитель 3-5 полей было показано. Бар: 100 мкм.
Рисунок 2. U87 ячейки вызванных канальцев в число клеток-зависимым образом. Различное число U87 клетки, как указано в углах были использованы для трубки образования. HMVECs были использованы для положительного контроля. Бар: 100 мм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для того чтобы этот анализ, чтобы преуспеть, качество Матригель должны быть проверены в первую очередь. Маленький образец может быть получен из BD Bioscience предварительного запуска методом с использованием HMVECs. Различные продукты партия может появиться разнородных качеств, в которых некоторые партии не обеспечивают оптимальные условия для трубки образования. Во-вторых, любые пузыри следует избегать аликвоту Матригель загружается в 96-луночных планшетах, потому что пузырьки могут нарушить трубочку образования. Если крошечные пузырьки находятся в хорошо, Матригель можно сразу же вернулся к первоначальному труб Матригель которые должны храниться на льду во время эксперимента. Кроме того, испытания клетки должны быть сохранены в скорости роста логарифмической фазы. Если какой-либо культурной условиях указывает медленный рост клеток происходят, они должны быть заменены на здоровые клетки. Наконец, анализ труб под микроскопом должно быть не более одного часа, если трубы не являются фиксированными, поскольку пониженной температурой (комнатной температуры) могут повлиять на формирование трубки. Весь анализ должен быть завершен в течение 24 часов, чтобы избежать нарушения трубчатых структурой, индуцированной гибели клеток. Хорошо известно, что трубка образование характеризуется множественными сотовой активированных процессов, включая миграции клеток, межклеточной адгезии, выживание и апоптоза. Например, миграция клеток и межклеточной адгезии заметны в трубке развития. После 24 часов, однако, значительная апоптоза клеток происходит в прекращена сети все чаще наблюдается. Это событие происходит, как в эндотелиальных клеток и опухолевых клеток полученных трубки образования.
Она складывается, что этот анализ имеет решающее значение для оценки активности опухолевого vasculogenic клетка в пробирке, событие, которое не зависит от эндотелиальных клеток связанных ангиогенеза. Здесь мы показали, что клеточная линия меланомы B16F1 и рак молочной железы линии MDA-MB-435 разработан сосудистой сети на Матригель, в соответствии с vasculogenic поведение этих типов опухолей у человека, а также на животных моделях 14-17. Хотя неспособность разработать сосудистой фенотип по HCT116 клеток на Матригель является механистически неизвестно, то предположили, что это сосудистое имущество может быть опухоль типа клеток зависимым. Было бы интересно знать, если HCT116 клетки теряют способность генерировать VM в естественных условиях по сравнению с B16F1 и MDA-MB-435 клеток. Таким образом, создание данного анализа имеет первостепенное значение в изучении биологии рака, сосудистых биологии, а также скрининга препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NCI R01 CA120659 (РС).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Biosciences | 47743-720 | |
| EBM2 kit | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| Nikon ECLIPSE TS100 microscope | Nikon Instruments |
References
- Shao, R., Guo, X. Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis. Biochemical & Biophysical Research Communications. 321, 788-794 (2004).
- Ribeiro, M. J. Hemostatic properties of the SV-40 transfected human microvascular endothelial cell line (HMEC-1). A representative in vitro model for microvascular endothelium. Thromb Res. 79, 153-1561 (1995).
- Ades, E. W. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99, 683-690 (1992).
- Shao, R. Acquired expression of periostin by human breast cancers promotes tumor angiogenesis through up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression. Molecular & Cellular Biology. 24, 3992-4003 (2004).
- Shao, R. YKL-40, a secreted glycoprotein, promotes tumor angiogenesis. Oncogene. 28, 4456-4468 (2009).
- Basu, G. D. A novel role for cyclooxygenase-2 in regulating vascular channel formation by human breast cancer cells. Breast Cancer Research. 8, R69-R69 (2006).
- Scavelli, C. Vasculogenic mimicry by bone marrow macrophages in patients with multiple myeloma. Oncogene. 27, 663-674 (2008).
- El Hallani, S. A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization: tubular vasculogenic mimicry. Brain. 133, 973-982 (2010).
- Maniotis, A. J. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. American Journal of Pathology. 155, 739-752 (1999).
- Hendrix, M. J., Seftor, E. A., Hess, A. R., Seftor, R. E. Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma. Nature Reviews Cancer. 3, 411-421 (2003).
- Folberg, R. Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns. American Journal of Pathology. 169, 1376-1389 (2006).
- Liu, C. Prostate-specific membrane antigen directed selective thrombotic infarction of tumors. Cancer Research. 62, 5470-5475 (2002).
- Sood, A. K. The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy. Cancer Biology & Therapy. 1, 661-664 (2002).
- Shirakawa, K. Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft. Cancer Research. 62, 560-566 (2002).
- Ruf, W. Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry. Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).
- Seftor, R. E. Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma. Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).
- Shirakawa, K. Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer. International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).
