Summary
एक ट्यूब गठन परख ट्यूमर कोशिकाओं के संवहनी गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Abstract
पिछले कई दशकों में, एक ट्यूब गठन परख विकास का उपयोग कर कारक कम Matrigel आम तौर पर 1-5 इन विट्रो में संवहनी endothelial कोशिकाओं की angiogenic गतिविधि का प्रदर्शन करने के लिए नियोजित किया गया है. हालांकि, हाल ही में बढ़ती सबूत से पता चला है कि इस परख के endothelial कोशिकाओं के लिए संवहनी व्यवहार का परीक्षण करने के लिए सीमित नहीं है. इसके बजाय, यह भी ट्यूमर कोशिकाओं के एक नंबर की क्षमता के लिए एक संवहनी 6-8 phenotype के विकास का परीक्षण किया गया इस्तेमाल किया गया है. यह क्षमता अपने vasculogenic xenotransplanted जानवर, एक vasculogenic अनुकरण (VM) 9 के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में पहचान व्यवहार के साथ संगत किया गया था . सबूत के एक भीड़ का प्रदर्शन है कि ट्यूमर सेल की मध्यस्थता VM के ट्यूमर के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, endothelial सेल 6 angiogenesis, 10-13 से स्वतंत्र है. उदाहरण के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं को रक्त, मेलेनोमा और glioblastoma 8 रोगियों, 10, 11 से perfused ऊतकों के नमूनों में संवहनी चैनल गठन में भाग लेने के लिए पाए गए. यहाँ, हम ट्यूमर कोशिकाओं की vasculogenic गतिविधि के मूल्यांकन में एक उपयोगी उपकरण के रूप में इस ट्यूबलर नेटवर्क परख वर्णित है. हमने पाया है कि B16F1 कोशिकाओं मेलेनोमा, U87 कोशिकाओं glioblastoma, और स्तन कैंसर की कोशिकाओं को एमडीए MB--435 के रूप में कुछ ट्यूमर सेल लाइनों संवहनी tubules के रूप में कर रहे हैं, लेकिन कुछ ऐसे बृहदान्त्र कैंसर HCT116 कोशिकाओं के रूप में नहीं. इसके अलावा, इस संवहनी phenotype सेल Matrigel पर मढ़वाया संख्या पर निर्भर है. इसलिए, इस परख शक्तिशाली संवहनी कोशिकाओं, ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह के रूप में अन्य कोशिकाओं सहित सेल प्रकार की एक किस्म की संभावित नाड़ी स्क्रीन उपयोगिता के रूप में सेवा कर सकता है.
Protocol
1. एक ट्यूब Matrigel आधारित संरचना परख ट्यूमर कोशिकाओं के Vasculogenic गतिविधि का आकलन
- ट्यूमर कोशिकाओं और microvascular endothelial कोशिकाओं की तैयारी: U87 कोशिकाओं, मेलेनोमा कोशिकाओं B16F1, स्तन कैंसर एमडीए MB-435, और बृहदान्त्र कोशिकाओं HCT116 जैसे मस्तिष्क ट्यूमर कोशिकाओं DMEM में बड़े हो रहे थे के साथ पूरक 10% FBS और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (Invitrogen से सभी ). Endothelial सेल लाइन मानव microvascular endothelial कोशिकाओं (HMVECs) EBM2 (Lonza) मध्यम 1 hydrocortisone / μg मिलीग्राम और 1 एनजी / एमएल epidermal वृद्धि कारक, 10% FBS और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक में सुसंस्कृत थे. कक्ष पीबीएस तीन बार से धोया गया और 0.05% trypsin / EDTA (Invitrogen) के साथ अलग. 5 मिनट के लिए 2000 rpm के साथ centrifugation के बाद, सेल छर्रों फिर पीबीएस के साथ धोया गया. फिर, pelleted कोशिकाओं एक hemocytometer के साथ गिना गया.
- Matrigel तैयारी: विकास की एक विभाज्य कारक कम Matrigel (बायोसाइंस बी) कमरे के तापमान पर गर्म किया गया था. से पहले पूरी तरह से thawed, यह बर्फ पर स्थानांतरित किया गया था और उसके तरल कम से कम 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखा गया था. फिर Matrigel के 50 μl कि Matrigel समान रूप से वितरित करने की अनुमति देता है एक क्षैतिज स्तर पर 96 अच्छी तरह प्लेटें मढ़वाया था, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए incubated
- ट्यूब गठन: कोशिकाओं को (4 x 10 1-2) endothelial कोशिकाओं के लिए ट्यूमर कोशिकाओं या EBM-2 के लिए सीरम मुक्त DMEM के साथ फिर से निलंबित कर दिया, और Matrigel के शीर्ष पर लोड. यदि इस परख छोटी नली विकास पर कुछ एजेंटों के प्रभाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था, इन एजेंटों (stimulators या inhibitors) सीरम मुक्त मध्यम करने के लिए जोड़ा गया. प्रत्येक सशर्त समूह 4-6 कुओं होता है.
- और डेटा विश्लेषण छवि: 37 के बाद ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस रातोंरात, प्रत्येक अच्छी तरह से सीधे एक खुर्दबीन के नीचे विश्लेषण किया गया था. यदि tubules निर्धारण के लिए आवश्यक थे, 10% formalin खारा आधारित समाधान के 100 μl धीरे और जोड़ा गया है दस मिनट बाद, यह विश्लेषण के लिए तैयार था. 10x चरण विपरीत के साथ एक खुर्दबीन के तहत, प्रत्येक क्षेत्र में tubules imaged थे और औसतन प्रत्येक कुएं में 3-5 यादृच्छिक क्षेत्रों से tubules गिना गया.
2. प्रतिनिधि परिणाम:
HMVECs एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया, के रूप में इन नलिकाओं स्पष्ट लम्बी सेल निकायों कि बहुभुज नेटवर्क के रूप में कनेक्ट से विकसित किए गए. B16F1, U87, और एमडीए MB--435 कोशिकाओं संवहनी tubules HMVECs द्वारा गठित उन लोगों के लिए इसी तरह विकसित की है, लेकिन HCT116 कोशिकाओं (चित्रा 1) नहीं किया. एक सेल ट्यूब खुराक पर निर्भर गठन U87 कोशिकाओं में परीक्षण किया गया था. चित्रा 2 में प्रदर्शन, 10,000 कोशिकाओं बंद tubules का गठन किया था. एक बार कोशिकाओं दोगुनी थे, एक ठोस संवहनी नेटवर्क HMVECs में देखा उन लोगों के लिए बराबर था. इसके विपरीत में, 5000 की तुलना में कम कोशिकाओं के लिए एक संवहनी phenotype के रूप में करने में विफल रहा है.
चित्रा 1 ट्यूब HMVECs, U87, एमडीए-MB-435, और B16F1 कोशिकाओं द्वारा प्रेरित है, लेकिन Matrigel पर नहीं थे कोशिकाओं HCT116. सभी कोशिकाओं (2 एक्स 10 4) लोड और रात में incubated गठन . Tubules चरण विपरीत का उपयोग imaged थे. HMVECs एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. 3-5 क्षेत्रों के एक प्रतिनिधि दिखाया गया था. बार: 100 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 2. U87 एक सेल संख्या निर्भर तरीके में सेल प्रेरित tubules U87 रूप में कोनों में संकेत कोशिकाओं के विभिन्न संख्या है. ट्यूब गठन के लिए इस्तेमाल किया गया. HMVECs एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया गया. बार: 100 मिमी.
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Discussion
इस परख को सफल करने के लिए आदेश में, Matrigel की गुणवत्ता पहली बार परीक्षण किया जाना चाहिए. एक छोटा सा नमूना बायोसाइंस BD से प्राप्त किया जा सकता है पूर्व HMVECs का उपयोग परख रन. विभिन्न बैच उत्पादों भिन्न गुणों में जो कुछ बहुत ट्यूब गठन के लिए एक इष्टतम स्थिति प्रदान नहीं करते हैं प्रदर्शित कर सकता है. दूसरा, किसी भी बुलबुले जब Matrigel के एक विभाज्य 96 अच्छी तरह प्लेटें में भरी हुई है से परहेज किया जाना चाहिए, क्योंकि बुलबुले छोटी नली गठन को बाधित कर सकते हैं. यदि छोटे बुलबुले में एक अच्छी तरह से पाया जाता है, Matrigel तुरंत मूल Matrigel ट्यूबों जो प्रयोग के दौरान बर्फ पर रखा जाना चाहिए किया जा सकता है वापस चले गए. इसके अलावा, परीक्षण कोशिकाओं के रूप में लॉग चरण में विकास दर में बनाए रखा जाना चाहिए. जब किसी भी सभ्य शर्तों कक्षों की धीमी वृद्धि का संकेत होते हैं, वे स्वस्थ कोशिकाओं के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. अंत में, एक खुर्दबीन के नीचे ट्यूबों के विश्लेषण के एक घंटे से अधिक लंबी नहीं हो सकता है अगर ट्यूबों क्योंकि कमी आई तापमान (कमरे के तापमान) ट्यूब गठन को प्रभावित कर सकता है तय नहीं कर रहे हैं चाहिए. कोशिका मृत्यु से प्रेरित ट्यूबलर संरचना का विघटन से बचने के पूरे परख 24 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए. यह सर्वविदित है कि ट्यूब गठन सेल प्रवास, सेल कोशिका आसंजन, अस्तित्व, और apoptosis सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं सक्रिय द्वारा विशेषता है. उदाहरण के लिए, सेल प्रवास और सेल कोशिका आसंजन ट्यूब विकास के दौरान ध्यान देने योग्य हैं. 24 घंटे के बाद, तथापि, महत्वपूर्ण सेल apoptosis जगह लेता है बंद नेटवर्क के रूप में तेजी से मनाया जाता है. यह घटना दोनों endothelial सेल और ट्यूमर सेल व्युत्पन्न ट्यूब गठन में होता है.
यह उभर रहा है कि इस परख में इन विट्रो, endothelial सेल जुड़े angiogenesis के स्वतंत्र घटना है कि ट्यूमर कोशिका vasculogenic गतिविधि के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ, हम पता चला है कि मेलेनोमा सेल लाइन B16F1 और स्तन कैंसर लाइन एमडीए MB--435 Matrigel पर विकसित संवहनी नेटवर्क, vasculogenic व्यवहार के साथ मानव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पशु 14-17 मॉडल में ट्यूमर के इन प्रकार के अनुरूप. हालांकि Matrigel पर HCT116 कोशिकाओं द्वारा एक संवहनी phenotype विकसित की विफलता mechanistically अज्ञात है, यह अनुमान लगाया है कि इस नाड़ी संपत्ति ट्यूमर सेल प्रकार निर्भर हो सकता है. यह पता है कि अगर HCT116 कोशिकाओं B16F1 और एमडीए MB--435 कोशिकाओं के साथ तुलना के रूप में vivo में VM उत्पन्न करने की क्षमता की कमी दिलचस्प होगा. इसलिए, इस परख की स्थापना के कैंसर जीव विज्ञान, नाड़ी जीव विज्ञान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दवा स्क्रीनिंग के अध्ययन में सर्वोपरि महत्व का है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम NCI R01 CA120659 (राज्यसभा) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Biosciences | 47743-720 | |
| EBM2 kit | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| Nikon ECLIPSE TS100 microscope | Nikon Instruments |
References
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