Ein Matrigel-Based Rohr Formation Assay zur vaskulären Aktivität von Tumorzellen Beurteilen

Summary

Ein Rohr-Assay wird verwendet, um vaskuläre Aktivität von Tumorzellen zu bewerten.

Abstract

Im Laufe der letzten Jahrzehnte, mit einem Rohr-Assay growth factor-reduzierten Matrigel wurde in der Regel eingesetzt, um die angiogene Aktivität des vaskulären endothelialen Zellen in vitro ^1-5 demonstrieren. Allerdings hat vor kurzem immer mehr Belege dafür ergeben, dass dieser Test nicht beschränkt auf vaskuläre Verhalten für Endothelzellen zu testen. Stattdessen hat sie auch benutzt worden, um die Fähigkeit einer Reihe von Tumorzellen zu einer vaskulären Phänotyp ^6-8 Entwicklung zu testen. Diese Fähigkeit wurde in Übereinstimmung mit ihren vaskulogene Verhalten in xenotransplantierten Tiere, ein Verfahren, wie vaskulogene Mimikry (VM) ⁹ bekannt sind, identifiziert. Es gibt eine Vielzahl von Nachweisen dafür, dass Tumor-Zell-vermittelten VM spielt eine wichtige Rolle bei der Tumorentwicklung, unabhängig von Endothelzellen Angiogenese ^{6, 10-13.} So wurden zum Beispiel Tumorzellen im Blut durchströmt, vaskuläre Kanalbildung in Gewebeproben aus Melanomen und Glioblastom-Patienten ^{8, 10, 11} zu beteiligen. Hier haben wir beschrieben, diese röhrenförmigen Netz-Assay als ein nützliches Instrument bei der Auswertung von vaskulären Aktivität von Tumorzellen. Wir fanden, dass einige Tumorzelllinien wie Melanom B16F1 Zellen, Glioblastom U87-Zellen, und Brustkrebs MDA-MB-435 Zellen in der Lage, vaskuläre Tubuli bilden; einige aber auch nicht wie Darmkrebs HCT116-Zellen. Darüber hinaus ist dieses vaskulären Phänotyp abhängig Zellzahlen auf dem Matrigel beschichtet. Daher kann dieser Test als leistungsstarkes Dienstprogramm für die vaskuläre Potenzial einer Vielzahl von Zelltypen einschließlich vaskulärer Zellen, Tumorzellen sowie anderen Zellen Bildschirm dienen.

Protocol

1. Ein Matrigel-Based Rohr Formation Assay zur vaskulären Aktivität von Tumorzellen Beurteilen

1. Vorbereitung der Tumorzellen und mikrovaskulären Endothelzellen: Hirntumor-Zellen wie U87-Zellen, Melanomzellen B16F1, Brustkrebs MDA-MB-435, und die Zellen des Darms HCT116 wurden in DMEM ergänzt mit 10% FBS und Penicillin / Streptomycin (alle von Invitrogen ). Endothelial Zelllinie humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMVECs) wurden in EBM2 Medium (Lonza) mit 1 pg / ml Hydrocortison und 1 ng / ml epidermal growth factor, 10% FBS und Penicillin / Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden mit PBS dreimal gewaschen und getrennt mit 0,05% Trypsin / EDTA (Invitrogen). Nach Zentrifugation mit 2.000 rpm für 5 min wurden Zellpellets erneut mit PBS gewaschen. Dann wurden die pelletierten Zellen mit einer Zählkammer gezählt.
2. Matrigel Zubereitung: Ein Aliquot von Wachstumsfaktor-reduzierten Matrigel (BD Bioscience) bis bei Raumtemperatur erwärmt. Bevor vollständig aufgetaut war es auf Eis überführt und seine Flüssigkeit wurde auf Eis für mindestens 10 min gehalten. Dann wurden 50 ul der Matrigel wurde 96-Well-Platten auf horizontaler Ebene, dass die Matrigel gleichmäßig zu verteilen ermöglicht ausplattiert und inkubiert für 30 min bei 37 ° C.
3. Rohr Bildung: Cells (1-2 x 10 ⁴⁾ wurden mit serumfreiem DMEM für Tumorzellen oder EBM-2 für Endothelzellen resuspendiert und lud auf der Oberseite des Matrigel. Wenn dieser Test zur Messung der Wirkung von einigen Agenten auf Tubulus Entwicklung verwendet wurde, wurden diese Mittel (Stimulatoren oder Inhibitoren), die Serum-freiem Medium aufgenommen. Jede bedingte Gruppe enthalten 4-6 Brunnen.
4. Bild-und Daten-Analyse: Nach der Inkubation bei 37 ° C über Nacht, wurde jede Vertiefung direkt unter dem Mikroskop analysiert. Wenn Tubuli zur Fixierung benötigt wurden, wurden 100 ul 10% igem Formalin Kochsalzlösung-basierte Lösung vorsichtig hinzugefügt und zehn Minuten später war es soweit für die Analyse. Unter einem Mikroskop mit 10x Phasenkontrast, wurden Tubuli in jedes Feld abgebildet und einem Durchschnitt von Tubuli 3 bis 5 zufälligen Feldern in jeder Vertiefung wurde gezählt.

2. Repräsentative Ergebnisse:

HMVECs wurden als positive Kontrolle verwendet, da diese Röhren aus klarem längliche Zellkörper, die Polygon-Netzwerk zu bilden verbinden entwickelt wurden. B16F1, U87 und MDA-MB-435 Zellen entwickelt vaskulären Tubuli ähnlich denen von HMVECs gebildet, aber HCT116 Zellen nicht (Abbildung 1). Eine Zelle dosisabhängig tube formation wurde in U87-Zellen getestet. Wie in Abbildung 2 gezeigt, gebildet 10.000 Zellen abgesetzt Tubuli. Sobald die Zellen wurden verdoppelt, war eine solide Gefäßnetz vergleichbar mit denen in HMVECs gesehen. Im Gegensatz dazu konnte Zellen weniger als 5.000 bis eine vaskuläre Phänotyp zu bilden.

Abbildung 1. Rohr-Bildung durch HMVECs, U87, MDA-MB-435 und B16F1 Zellen induziert, aber nicht HCT116-Zellen. Alle Zellen (2 x 10 ⁴⁾ wurden auf Matrigel geladen und über Nacht inkubiert. Tubuli wurden aufgenommen mit Phasenkontrast. HMVECs wurden als positive Kontrolle verwendet. Ein Vertreter von 3-5 Felder zu sehen war. Bar: 100 um.

Abbildung 2. U87-Zell-induzierte Tubuli in einer Zellzahl-abhängigen Weise. Verschiedene Zahlen von U87-Zellen als in den Ecken angegeben wurden tube formation verwendet. HMVECs wurden für eine positive Kontrolle verwendet. Bar: 100 mm.

Discussion

Um für diesen Test erfolgreich zu sein, sollte die Qualität der Matrigel zuerst getestet werden. Eine kleine Probe von BD Bioscience erhalten werden, um Vorlauf der Test unter Verwendung von HMVECs. Verschiedene Produkte können Batch-Display ungleichen Qualitäten, in denen einige viel nicht bieten eine optimale Voraussetzung für tube formation. Zweitens sollten alle Blasen vermieden werden, wenn ein Aliquot von Matrigel in 96-Well-Platten geladen werden, da Blasen Tubulus Bildung stören können. Wenn kleine Bläschen in einem gut gefunden werden, können die Matrigel zog sofort wieder auf den ursprünglichen Matrigel Röhren, die auf dem Eis während des Experiments gehalten werden sollte. Darüber hinaus sollte geprüft Zellen in einer Wachstumsrate bei einer log-Phase aufrecht erhalten werden. Wenn eine kultivierte Bedingungen angibt, langsame Wachstum der Zellen auftreten, sollten sie mit gesunden Zellen ersetzt werden. Schließlich sollte die Analyse der Rohre unter dem Mikroskop nicht länger als eine Stunde, wenn die Rohre sind nicht festgelegt, da ging (Raumtemperatur) tube formation beeinträchtigen könnten. Der ganze Test sollte innerhalb von 24 Stunden abgeschlossen werden, um Störungen der röhrenförmige Struktur von Zelltod induziert zu vermeiden. Es ist bekannt, dass das Rohr Bildung von mehreren zellulären aktivierte Prozesse wie Zellmigration, Zell-Zell-Adhäsion, das Überleben und Apoptose gekennzeichnet ist. Zum Beispiel sind die Zellmigration und Zell-Zell-Adhäsion während der Röhre Entwicklung bemerkbar. Nach 24 Stunden erfolgt jedoch signifikante Apoptose Platz als nicht fortgeführte Netzwerk zunehmend beobachtet wird. Dieses Ereignis tritt in beiden Endothelzellen und Tumorzellen abgeleiteten tube formation.

Es bildet sich, dass dieser Test von entscheidender Bedeutung für die Bewertung von Tumorzellen vaskulogene Aktivität in vitro, den Fall, dass unabhängig von endothelialen Zell-assoziierten Angiogenese ist. Hier haben wir gezeigt, dass Melanom-Zelllinie B16F1 und Brustkrebs Linie MDA-MB-435 entwickelt Gefäßnetze auf Matrigel, im Einklang mit vaskulären Verhalten dieser Arten von Tumoren in menschlichen als auch im Tiermodell ^14-17. Obwohl das Fehlen einer vaskulären Phänotyp von HCT116-Zellen auf Matrigel zu entwickeln, ist mechanistisch unbekannt, wird spekuliert, dass dieser Kreislauf Eigenschaft kann Tumor Zelltyp abhängig sein. Es wäre interessant zu wissen, ob HCT116-Zellen die Fähigkeit, VM in vivo im Vergleich zu B16F1 und MDA-MB-435 Zellen zu generieren fehlt. Daher ist die Einrichtung dieses Tests von entscheidender Bedeutung für das Studium der Tumorbiologie, vaskuläre Biologie sowie Wirkstoff-Screening.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11995
FBS	Invitrogen	16000-044
Growth factor-reduced Matrigel	BD Biosciences	47743-720
EBM2 kit	Lonza Inc.	CC-3156
Nikon ECLIPSE TS100 microscope	Nikon Instruments