Summary
Assay הקמת הצינור משמש להערכת פעילות כלי הדם של תאים סרטניים.
Abstract
במהלך העשורים האחרונים, assay היווצרות צינור באמצעות גורם הגדילה מופחת Matrigel כבר מועסקים בדרך כלל כדי להדגים את פעילות angiogenic לתאי אנדותל של כלי דם במבחנה 1-5. עם זאת, הראיות לאחרונה גדל הראה כי זה assay אינו מוגבל לבחון את התנהגותו של כלי הדם ותאי האנדותל. במקום זאת, הוא גם נעשה שימוש כדי לבחון את היכולת של מספר תאים סרטניים לפתח פנוטיפ וסקולרית 6-8. יכולת זו עולה בקנה אחד עם התנהגות vasculogenic שלהם מזוהה בחיות xenotransplanted, תהליך המכונה vasculogenic חיקוי (VM) 9. יש שפע של ראיות להוכיח כי VM גידול התא בתיווך ממלא תפקיד חיוני בהתפתחות הגידול, עצמאית של אנגיוגנזה תא האנדותל 6, 10-13. לדוגמה, תאים סרטניים נמצאו להשתתף היווצרות perfused דם, כלי דם בתוך ערוץ דגימות רקמה של חולים מלנומה גליובלסטומה 8, 10, 11. כאן, אנו תיאר assay רשת צינורי ככלי שימושי להערכת הפעילות vasculogenic של תאים סרטניים. מצאנו כי כמה שורות תאים סרטניים כגון מלנומה B16F1 תאים, גליובלסטומה U87 תאים סרטן השד מד"א-MB-435 תאים מסוגלים טופס tubules כלי הדם, אך יש כאלה שלא כמו סרטן המעי הגס HCT116 תאים. יתר על כן, זה פנוטיפ כלי הדם תלויה מספרים התא מצופה על Matrigel. לכן, assay זה עשוי לשמש כלי רב עוצמה למסך את הפוטנציאל של כלי הדם של מגוון רחב של סוגי תאים כולל תאים של כלי הדם, תאים סרטניים, כמו גם תאים אחרים.
Protocol
1. Matrigel מבוסס גיבוש Tube Assay להעריך את פעילות Vasculogenic של תאים סרטניים
- הכנת תאים סרטניים לתאי אנדותל כלי הדם: גידול במוח תאים כגון U87 תאים, התאים B16F1 מלנומה, סרטן השד MDA-MB-435, ותאי המעי הגס HCT116 גדלו DMEM בתוספת 10% FBS ו פניצילין / סטרפטומיצין (כולם Invitrogen ). האנדותל קו התא בתאי אדם אנדותל כלי הדם (HMVECs) היו בתרבית בינוני EBM2 (Lonza) בתוספת הידרוקורטיזון מיקרוגרם / מ"ל ו - 1 1 ng / ml גורם הגדילה באפידרמיס, 10% FBS ו פניצילין / סטרפטומיצין. תאים נשטפו עם PBS שלוש פעמים מנותקת עם 0.05% טריפסין / EDTA (Invitrogen). לאחר צנטריפוגה עם 2,000 סל"ד 5 דקות, כדורי תא נשטפו שוב עם PBS. לאחר מכן, התאים pelleted נמנו עם hemocytometer.
- הכנה Matrigel: aliquot של גורם הגדילה מופחת Matrigel (BD Bioscience) היה מחומם בטמפרטורת החדר. לפני מופשר לחלוטין, הועבר על גבי קרח נוזלי שלה הוחזק על קרח דק 'לפחות 10. ואז 50 μl של Matrigel היה מצופה כדי 96-היטב צלחות ברמה אופקי המאפשר Matrigel להפיץ באופן שווה מודגרות למשך 30 דקות ב 37 ° C.
- היווצרות Tube: תאים (1-2 x 10 4) מחדש מושעה עם סרום ללא DMEM של תאים סרטניים או EBM-2 עבור בתאי האנדותל, והעמיסו על החלק העליון של Matrigel. אם זה assay שימש למדידת ההשפעות של כמה סוכנים על פיתוח אבובית, סוכנים אלה (לגירוי או מעכבי) נוספו בינוני סרום ללא. כל קבוצה מותנית הכלול 4-6 בארות.
- תמונה וניתוח נתונים: לאחר דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כל אחד גם נותח ישירות תחת מיקרוסקופ. אם tubules נדרשו עבור קיבעון, 100 μl של פתרון 10% מלוחים מבוססי פורמלין נוספה בעדינות ועשר דקות מאוחר יותר, הוא היה מוכן לניתוח. תחת מיקרוסקופ עם ניגודיות שלב 10x, tubules בכל תחום היו הדמיה ו בממוצע tubules 3-5 שדות אקראי היטב כל נמנה.
2. נציג תוצאות:
HMVECs שימשו כביקורת חיובית, כמו אלה שפותחו tubules ברור גופי התא מוארך המתחברים בצורה רשת מצולע. תאים B16F1, U87, ואת מד"א-MB-435 שפותחה tubules כלי הדם דומה לזו שהוקמה על ידי HMVECs, אבל HCT116 תאים לא (איור 1). היווצרות תא מינון תלויי הצינור נבדק U87 תאים. כפי שמודגם באיור 2, 10,000 תאים נוצרו tubules הופסק. לאחר התאים הוכפלו, רשת כלי הדם היה מוצק דומים לאלה לראות HMVECs. לעומת זאת, התאים פחות מ 5000 לא הצליחו ליצור פנוטיפ וסקולרית.
באיור 1. היווצרות Tube המושרה על ידי HMVECs, U87, מד"א-MB-435, ו B16F1 תאים, אך לא HCT116 תאים. כל התאים (2 x 10 4) הועמסו על Matrigel ו מודגרות לילה. Tubules היו צילמו באמצעות הניגוד שלב. HMVECs שימשו כביקורת חיובית. נציג של 3-5 שדות הוצגה. בר: 100 מיקרומטר.
2. איור U87 תא-Induced tubules במספר תלויי תא אופן. מספרים שונים של תאים U87 כפי בפינות שימשו להקמת הצינור. HMVECs שימשו בקרה חיובית. בר: 100 מ"מ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על מנת assay הזה להצליח, איכות Matrigel יש לבדוק תחילה. מדגם קטן ניתן לקבל BD Bioscience מראש בטווח assay באמצעות HMVECs. מוצרים אצווה שונים עשויים להציג איכויות שונה שבו הרבה מסוימים אינם מספקים מצב אופטימלי להקמת הצינור. שנית, כל הבועות יש להימנע כאשר aliquot של Matrigel נטען צלחות 96 ובכן, מפני היווצרות בועות יכולים לשבש אבובית. אם בועות קטנטנות מצויים היטב, Matrigel ניתן להעביר מיד בחזרה את הצינורות Matrigel המקורי שאמור להיות כל הזמן על הקרח במהלך הניסוי. בנוסף, נבדקו תאים יש לשמור על קצב צמיחה בשלב יומן. כאשר כל התנאים תרבותי המעיד על צמיחה איטית של התאים מתרחשת, הם צריכים להיות מוחלפים בתאים בריאים. לבסוף, ניתוח של צינורות מתחת למיקרוסקופ צריך להיות לא יותר משעה אם הצינורות אינם קבועים כי הטמפרטורה ירדה (טמפרטורת החדר) יכול להשפיע על היווצרות צינור. Assay כולו אמור להסתיים תוך 24 שעות, כדי למנוע שיבוש במבנה צינורי המושרה על ידי מוות של תאים. עובדה ידועה היא כי היווצרות צינור מאופיין הסלולר פעילה בתהליכים מרובים כולל נדידת תאים, תאים תאים הידבקות, הישרדות, אפופטוזיס. לדוגמה, נדידת תאים ו תאים תאים הידבקות ניכרים במהלך התפתחות הצינור. לאחר 24 שעות, לעומת זאת, אפופטוזיס תא משמעותי מתרחש כרשת הופסק הוא ציין יותר ויותר. אירוע זה מתרחש בתא הן אנדותל היווצרות הגידול תא הנגזרות צינור.
זה המתעוררים assay זה הוא קריטי להערכת תאים סרטניים במבחנה vasculogenic פעילות, אירוע שאינו תלוי אנגיוגנזה תאים הקשורים האנדותל. כאן, אנו הראו כי תא מלנומה קו B16F1 ו סרטן השד הקו מד"א-MB-435 רשתות כלי דם שפותחה על Matrigel, עולה בקנה אחד עם התנהגות vasculogenic של סוגים אלה של גידולים אנושיים, כמו גם בבעלי חיים 14-17. למרות הכישלון לפתח פנוטיפ כלי דם על ידי תאים HCT116 Matrigel אינו ידוע באופן מכניסטי, הוא העריך כי מאפיין זה עשוי להיות סוג של כלי הדם תאים סרטניים תלוי. יהיה מעניין לדעת אם HCT116 תאים חסרים את היכולת ליצור VM in vivo לעומת B16F1 ואת מד"א-MB-435 תאים. לפיכך, הקמתה של assay זו היא בעלת חשיבות עליונה בחקר הביולוגיה סרטן, ביולוגיה של כלי הדם, כמו גם הקרנת סמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NCI R01 CA120659 (RS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Biosciences | 47743-720 | |
| EBM2 kit | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| Nikon ECLIPSE TS100 microscope | Nikon Instruments |
References
- Shao, R., Guo, X. Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis. Biochemical & Biophysical Research Communications. 321, 788-794 (2004).
- Ribeiro, M. J. Hemostatic properties of the SV-40 transfected human microvascular endothelial cell line (HMEC-1). A representative in vitro model for microvascular endothelium. Thromb Res. 79, 153-1561 (1995).
- Ades, E. W. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99, 683-690 (1992).
- Shao, R. Acquired expression of periostin by human breast cancers promotes tumor angiogenesis through up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression. Molecular & Cellular Biology. 24, 3992-4003 (2004).
- Shao, R. YKL-40, a secreted glycoprotein, promotes tumor angiogenesis. Oncogene. 28, 4456-4468 (2009).
- Basu, G. D. A novel role for cyclooxygenase-2 in regulating vascular channel formation by human breast cancer cells. Breast Cancer Research. 8, R69-R69 (2006).
- Scavelli, C. Vasculogenic mimicry by bone marrow macrophages in patients with multiple myeloma. Oncogene. 27, 663-674 (2008).
- El Hallani, S. A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization: tubular vasculogenic mimicry. Brain. 133, 973-982 (2010).
- Maniotis, A. J. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry. American Journal of Pathology. 155, 739-752 (1999).
- Hendrix, M. J., Seftor, E. A., Hess, A. R., Seftor, R. E. Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma. Nature Reviews Cancer. 3, 411-421 (2003).
- Folberg, R. Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns. American Journal of Pathology. 169, 1376-1389 (2006).
- Liu, C. Prostate-specific membrane antigen directed selective thrombotic infarction of tumors. Cancer Research. 62, 5470-5475 (2002).
- Sood, A. K. The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy. Cancer Biology & Therapy. 1, 661-664 (2002).
- Shirakawa, K. Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft. Cancer Research. 62, 560-566 (2002).
- Ruf, W. Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry. Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).
- Seftor, R. E. Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma. Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).
- Shirakawa, K. Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer. International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).
