Summary
Civciv bıldırcın kuruntulardan ve odak boya etiketleme dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar kullanarak hücre kaderi harita deneyler için embriyo erişilebilirlik kolaylığı sağladı. Bu yazıda, uzun sağkalım süreleri için optimize edilmiş bir yumurta hazırlama yöntemi göstermektedir.
Abstract
Gelişme çalışma büyük ölçüde deneysel bir model olarak civciv embriyo kullanımı yardımıyla olmuştur. Civciv bıldırcın kuruntulardan ve odak boya etiketleme dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar kullanarak hücre kaderi harita deneyler için embriyo erişilebilirlik kolaylığı sağladı. Buna ek olarak, ovo elektroporasyon kullanarak plazmid DNA, protein kaplı boncuklar ve giriş yerleştirilmesi de dahil olmak üzere çeşitli moleküler tedirginlikler sağlar. Bu deneyler, merkezi ve periferik sinir sistemi gelişimi hakkında önemli veriler vermiştir. Bu çalışmaların çoğu için, kabuğu açık ve embriyonun büyüme rahatsızlık vermesini olmadan Sık kalkış için gereklidir. Embriyo, yumurta kabuğu yeniden açarak izleyen gelişim evreleri incelenebilir. Bu makalede, tavuk yumurtası açmak için birkaç mükemmel bir yöntem olmakla birlikte uzun sağkalım süreleri için optimize edilmiş bir yöntem göstermektedir. Bu yöntemde, yumurta yan dayanmaktadır ve küçük bir pencere kabuk kesilir. Deneysel işlemin ardından, kabuk, yumurta gelişimi süresince kapsayacak şekilde kullanılır. Kabuğu örten şeffaf plastik bant embriyo korur ve kuluçka dönemi kalan sırasında hidrasyon korumak yardımcı olur. Bu yöntem, iki gün inkübasyon başında kullanılır olmuştur ve olgun embriyonik çağlar boyunca hayatta kalma izin verdi.
Protocol
1. Inkübatör gelen yumurta çıkarın
- 37 o C'da C bağıl nem% 60 üstünde.
- Yumurta çıkarın; yumurta 90 ° döndürün, böylece büyük temel yatay yatıyor.
2. Sterilize etmek için Swab yumurta
- % 70 etanol ile non-steril gazlı bez bir yığın Doymuş.
- 2-3 adet 5 yumurta kadar çubukla kullanın. Gazlı bez kirli atın.
3. Albümin kaldırılması sitesi hazırlanması
- Albümin çekilecek alanını korumak için temel sol 3M plastik bant 1 "x 1" parça kesin ve yerleştirin.
4. Albümin, kaldırılması
- Bandın ortasında küçük bir delik yapmak için bir makas noktasını kullanın.
- 18-gauge iğne, 1-inç ile 10 cc şırınga kullanarak yavaş yavaş makas tarafından yapılan delikten iğne delin.
- Iğne yumurta alt kısmına doğru 45 ° C açıyla aşağı çekmek.
- Iğne merkezine doğru yatırın ve albümin 3 ila 4 ml çizin.
5. Pencereleme
- Plastik bant 3 "x 3" parça kesin ve yumurtanın üstüne uyacak şekilde germek. Çok sert çekmek için dikkatli olmak, yumurta yatay yüzey yuvarlak uçları etrafında kare köşeler uzatın. Hiçbir kıvrımları ile yumurta yüzeyine karşı sıkı bir şekilde bant çekin.
- Bant yerleştirildi alanın alt ortasında bir delik bir çift keskin düz 4 "diseksiyon makas kullanarak, bükün. Içini karşı ipuçları yetişmek için emin olmak yumurtanın içine yavaş yavaş alt bıçak, makas kılavuzu kabuk üssüne doğru bıçak Doğrudan ve yavaş yavaş kabuk kesmek başlamak. saat yönünün tersine bir biçimde devam edin, sadece üst merkeze ulaşmadan önce durdurulması, sadece küçük bir bit kadar makas çıkarın ve ters yönde gidiyor tekrar yumurta bağlı yumurta döllenmiş olduğundan emin olmak için kontrol edin. pencereyi kapatın kalır.
6. Kapanış yeniden açılması ve yumurta sızdırmazlık.
- Geniş plastik bant "uzun, 1 / 2" 2-3 hakkında kesin ve pencereyi kapatmaya kesildi deliğin içine sığacak kadar. Bant başka bir 1 x 1 "parça alın ve yumurta drene olduğu delik mühür her türlü manipülasyonlar yapmak için yumurta yeniden forseps bir çift kullanın. Inkübatör yumurta dönmeye hazır olduğunuzda, bir parça kesti pencere mühür ve yumurta tüm yatay yüzey kapağı için yeterince büyük bir bant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem deneysel manipülasyonlar uzun sağkalım süreleri sağlar. Örneğin, boya-etiketleme çalışmaları, E10 ya da daha sonra bir kader haritalama çalışması (1) hayatta kalma izin verdi. Buna ek olarak, gen ekspresyon seviyelerinin değiştirilmesi ve daha sonra gelişimsel aşamaları (2-6) devam etmek için gerekli geliştirme ovo elektroporasyon çalışmalarda kullanılmaktadır. Bu pencere tekniği embriyo manipülasyonları sonra hayatta kalma gerektiren herhangi bir işlem ile birlikte kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
- Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).
- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
