Summary
La facilidad de acceso del embrión ha permitido experimentos para trazar los destinos de células usando varios métodos, incluyendo pollo codorniz quimeras y tinte de etiquetado focal. En este artículo se demuestra un método de preparación de huevo que se ha optimizado el tiempo de supervivencia de largo.
Abstract
El estudio de desarrollo ha sido muy favorecida por el uso del embrión de pollo como modelo experimental. La facilidad de acceso del embrión ha permitido experimentos para trazar los destinos de células usando varios métodos, incluyendo pollo codorniz quimeras y tinte de etiquetado focal. Además, permite que las perturbaciones moleculares de varios tipos, incluyendo la colocación de revestimiento de proteínas cuentas y la introducción de ADN plásmido en el uso de la electroporación in ovo. Estos experimentos han arrojado datos importantes en el desarrollo de los sistemas nerviosos central y periférico. Para muchos de estos estudios, es necesario para abrir la cáscara del huevo y volver a cerrar sin perturbar el crecimiento del embrión. El embrión puede ser examinado en las sucesivas etapas de desarrollo en la reapertura de la cáscara del huevo. Aunque existen varios métodos excelentes para la apertura de los huevos de gallina, en este artículo se demuestra un método que se ha optimizado el tiempo de supervivencia de largo. En este método, el huevo descansa sobre un costado y una pequeña ventana se corta en la cáscara. Después del procedimiento experimental, la cáscara se usa para cubrir el huevo de la duración de su desarrollo. Cinta de plástico transparente que recubre la cáscara del huevo protege al embrión y ayuda a retener la hidratación durante el resto del período de incubación. Este método ha sido utilizado a partir de dos días de incubación, y ha permitido la supervivencia a través de las edades maduras de embriones.
Protocol
1. Eliminar los huevos de la incubadora
- Mantener a 37 ° C con una humedad relativa superior al 60% establecido.
- Eliminar los huevos; a su vez los huevos a 90 ° para que la gran base se encuentra horizontal.
2. Hisopo para esterilizar los huevos
- Saturar un montón de no-gasa estéril con 70% de etanol.
- Usar dos o tres piezas para limpiar hasta 5 huevos. Descartar la gasa cuando está sucia.
3. Albúmina de la preparación del sitio eliminación
- Corte y el lugar de 1 "x 1" pedazo de cinta de plástico de 3M acaba de salir de la base para proteger el área donde la albúmina se extraerán.
4. La eliminación de la albúmina
- Use la punta de un par de tijeras para hacer un pequeño agujero en el centro de la cinta.
- Con una jeringa de 10 cc con un calibre 18, aguja de 1 pulgada, poco a poco de perforación de la aguja a través del agujero hecho por las tijeras.
- Unidad de la aguja hacia abajo en un ángulo de 45 ° C hacia la parte inferior del huevo.
- Inclinación de la aguja hacia el centro y sacar un 3 a 4 ml de albúmina.
5. Ventanas
- Corte de 3 "x 3" pedazo de cinta de plástico y se extienden para que quepa en la parte superior del huevo. Extender las esquinas de la plaza alrededor de los extremos redondeados de la superficie horizontal de los huevos, con cuidado de no tirar con demasiada fuerza. Tire de la cinta para que quede apretada contra la superficie de los huevos sin pliegues.
- Con un par de afiladas tijeras de disección rectas 4 ", giro de un agujero en el centro de la parte inferior de la zona donde se colocó la cinta. Lentamente guía de la cuchilla inferior de las tijeras en el óvulo y asegúrese de mantener la punta contra el interior de la cáscara. directa de la hoja hacia la base y poco a poco comienzan a cortar la cáscara. Proceda de forma hacia la izquierda, deteniéndose justo antes de llegar a la parte superior central. Retire las tijeras y repetir va en la dirección opuesta hasta que sólo una pequeña porción de la huevo permanece unido. Verifique que el óvulo es fecundado. Cierra la ventana.
6. De cierre, la reapertura y el sellado del huevo.
- Corte de un 3.2 "de largo por 1 / 2" de ancho de cinta de plástico y cierre la ventana de lo que cabe en el agujero que fue cortado. Tome otra de 1 x 1 "pedazo de cinta y sellar el agujero desde el que se drena el huevo. Use un par de pinzas para volver a abrir el huevo para hacer cualquier manipulación. Cuando esté listo para volver los huevos a la incubadora, corte un pedazo de la cinta que es lo suficientemente grande como para sellar la ventana y cubrir toda la superficie horizontal del huevo.
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Discussion
Este método permite que el tiempo de supervivencia a largo después de las manipulaciones experimentales. Por ejemplo, el etiquetado de tinte estudios permitieron la supervivencia de E10 o más tarde en un estudio de mapeo destino (1). Además, se ha utilizado en estudios de electroporación in ovo que proporcionan la alteración de los niveles de expresión génica y el desarrollo necesario para proceder a las etapas posteriores del desarrollo (2-6). Esta técnica de ventanas se pueden utilizar en combinación con cualquier otro procedimiento que requiere la supervivencia después de la manipulación del embrión.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
- Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).
- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
