Summary
La facilità di accessibilità di un embrione ha permesso per gli esperimenti di mappare i destini delle cellule utilizzando diversi approcci, tra cui pulcino di quaglia chimere ed etichettatura colorante focale. In questo articolo mostriamo un metodo di preparazione uovo che è stato ottimizzato per i lunghi tempi di sopravvivenza.
Abstract
Lo studio di sviluppo è stato molto semplificato dall'uso del embrione di pollo come modello sperimentale. La facilità di accessibilità di un embrione ha permesso per gli esperimenti di mappare i destini delle cellule utilizzando diversi approcci, tra cui pulcino di quaglia chimere ed etichettatura colorante focale. Inoltre, consente di perturbazioni molecolare di diversi tipi, tra cui il posizionamento di proteine rivestite perle e l'introduzione di DNA plasmidico mediante elettroporazione in ovo. Questi esperimenti hanno fornito dati importanti per lo sviluppo del sistema nervoso centrale e periferico. Per molti di questi studi, è necessario aprire il guscio d'uovo e richiudere senza perturbare la crescita dell'embrione. L'embrione può essere esaminata a successivi stadi di sviluppo con la riapertura del guscio d'uovo. Mentre ci sono diversi metodi eccellente per l'apertura di uova di gallina, in questo articolo si dimostra un metodo che è stato ottimizzato per i lunghi tempi di sopravvivenza. In questo metodo, l'uovo si basa su un lato e una piccola finestra è tagliata nella shell. Dopo la procedura sperimentale, la shell viene utilizzato per coprire l'uovo per la durata del suo sviluppo. Nastro in plastica trasparente sovrastante il guscio protegge l'embrione e aiuta a mantenere l'idratazione durante il resto del periodo di incubazione. Questo metodo è stato utilizzato a partire due giorni di incubazione e ha permesso la sopravvivenza attraverso matura età embrionale.
Protocol
1. Rimuovere le uova da incubatore
- Mantenere a 37 ° C con umidità relativa di sopra del 60%.
- Rimuovere le uova; girare le uova 90 ° in modo che la base di grandi dimensioni si trova orizzontale.
2. Tampone uova di sterilizzare
- Saturare una pila di garza non sterile con 70% di etanolo.
- Utilizzare 2-3 pezzi per tampone fino a 5 uova. Scartare quando la garza è sporca.
3. Preparazione albume sito rimozione
- Tagliare e inserire un 1 pezzo "x 1" di nastro in plastica 3M appena lasciato la base per proteggere la zona dove l'albumina saranno tratti.
4. Rimozione di albume
- Utilizzare la punta di un paio di forbici per fare un piccolo foro al centro del nastro.
- Usando una siringa da 10 cc con una 18-gauge, 1-inch ago, forare lentamente l'ago attraverso il foro praticato dalle forbici.
- Guidare l'ago fino ad un angolo di 45 ° C verso il fondo dell'uovo.
- Inclinare l'ago verso il centro ed elaborare 3-4 ml di albume.
5. Windowing
- Tagliare un 3 "x 3" pezzo di nastro adesivo di plastica e si estendono per adattarlo in cima l'uovo. Estendere gli angoli della piazza intorno alle estremità arrotondate della superficie orizzontale delle uova, facendo attenzione a non tirare troppo duro. Tirare il nastro in modo che sia tenuta contro la superficie delle uova, senza pieghe.
- Utilizzando un paio di nitide-dritto 4 "forbici dissezione, torcere un buco in basso al centro dell'area dove è stato messo del nastro. Lentamente guidare la lama inferiore delle forbici nell'uovo avendo cura di tenere le punte contro l'interno della il guscio. diretto la lama verso la base e lentamente cominciano a tagliare il guscio. procedere in senso antiorario moda, fermandosi poco prima di raggiungere il centro in alto. Rimuovere le forbici e ripetere andando nella direzione opposta fino a quando solo un po 'piccolo del uovo rimane attaccato. Verificare che l'ovulo è fecondato. chiudere la finestra.
6. Chiusura, la riapertura e la sigillatura l'uovo.
- Taglio di un 2-3 "lungo da 1 / 2" nastro di plastica largo e chiudere la finestra in modo che si inserisce di nuovo nel buco che è stato tagliato. Prendiamo un altro x 1 "1 pezzo di nastro adesivo e sigillare il foro da cui è stato drenato l'uovo. Utilizzare un paio di pinze per riaprire l'uovo di fare qualsiasi manipolazione. Quando si è pronti a tornare le uova nell'incubatrice, tagliare un pezzo del nastro che è abbastanza grande per sigillare la finestra e coprire l'intera superficie orizzontale dell'uovo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo metodo permette di lunghi tempi di sopravvivenza dopo manipolazioni sperimentali. Per esempio, dye-etichettatura studi hanno permesso la sopravvivenza di E10 o poi in uno studio di rilevamento destino (1). Inoltre, è stato utilizzato per gli studi in elettroporazione ovo che forniscono l'alterazione dei livelli di espressione genica e sviluppo necessari per procedere alle fasi successive di sviluppo (2-6). Questa tecnica finestre può essere utilizzato in combinazione con qualsiasi procedura che richiede la sopravvivenza dopo le manipolazioni per l'embrione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
- Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).
- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
