Summary
Die leichte Zugänglichkeit des Embryos ist für Experimente erlaubt Zellanlagen verschiedene Möglichkeiten, einschließlich Küken Wachtel Chimären und Schwerpunkte Farbstoffmarkierung Karte. In diesem Artikel zeigen wir ein Ei Herstellungsmethode, die für längere Überlebenszeiten optimiert wurde.
Abstract
Das Studium der Entwicklung wurde stark durch die Verwendung des Hühnerembryo als experimentelles Modell unterstützt. Die leichte Zugänglichkeit des Embryos ist für Experimente erlaubt Zellanlagen verschiedene Möglichkeiten, einschließlich Küken Wachtel Chimären und Schwerpunkte Farbstoffmarkierung Karte. Darüber hinaus ermöglicht es der molekularen Störungen von mehreren Arten, darunter Vermittlung von Protein-beschichteten Beads und Einführung von Plasmid-DNA mit in ovo Elektroporation. Diese Experimente haben wichtige Daten über die Entwicklung des zentralen und peripheren Nervensystems ergab. Für viele dieser Studien ist es notwendig, die Eierschale öffnen und wieder ohne Störung des Embryos Wachstum. Der Embryo kann in aufeinanderfolgenden Entwicklungsstadien durch erneutes Öffnen der Eischale untersucht werden. Es gibt zwar mehrere ausgezeichnete Methoden für die Öffnung der Hühnereier, die in diesem Artikel werden wir zeigen, eine Methode, die für lange Überlebenszeiten optimiert wurde. Bei dieser Methode liegt das Ei auf seiner Seite und ein kleines Fenster in die Schale geschnitten. Nach dem experimentellen Verfahren wird die Shell benutzt, um das Ei für die Dauer ihrer Entwicklung zu decken. Klare Plastikband über der Eierschale schützt den Embryo und halten die Feuchtigkeit während der Rest der Inkubationszeit. Diese Methode wurde Anfang an zwei Tagen der Inkubation eingesetzt und ermöglichte das Überleben durch ausgereifte embryonalen Alters.
Protocol
1. Entfernen Sie Eier aus Inkubator
- Halten bei 37 ° C bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von über 60% gesetzt.
- Entfernen Sie die Eier, Eier wiederum 90 °, so dass die große Basis horizontal liegt.
2. Swab Eier zu sterilisieren
- Tränken Sie einen Stapel von nicht-steriler Gaze mit 70% Ethanol.
- Verwenden Sie zwei vor drei Stücke Tupfer bis zu 5 Eier. Verwerfen, wenn die Gaze verschmutzt ist.
3. Vorbereitung Eiweiß Entnahmestelle
- Cut und setzen Sie eine 1 "x 1" Stück von 3M Kunststoffband nur von der Basis nach links, um den Bereich, wo die Albumin durchgeführt wird, gezogen zu schützen.
4. Entfernung von Eiweiß
- Verwenden Sie die Spitze einer Schere ein kleines Loch in der Mitte des Bandes machen.
- Mit einem 10-ml-Spritze mit einer 18-Gauge-, 1-Zoll-Nadel langsam bohren die Nadel durch das Loch von der Schere gemacht.
- Fahren Sie die Nadel in einem 45 ° C Winkel in Richtung der Unterseite des Eies.
- Kippen Sie die Nadel gegen die Mitte und erarbeiten von 3 bis 4 ml Albumin.
5. Windowing
- Schneiden Sie ein 3 "x 3" Stück Plastik Band und ziehen Sie es auf die Spitze des Eis fit. Verlängern Sie die Ecken des Quadrates um die abgerundeten Enden der horizontalen Fläche der Eier, man aufpassen, nicht zu ziehen zu hart. Ziehen Sie das Band so, dass es eng an der Oberfläche der Eier ohne Falten.
- Mit ein paar scharfen geraden 4 "dissection Scheren, Torsion ein Loch in der unteren Mitte des Gebietes, wo das Band gelegt wurde. Langsam Führer der unteren Klinge der Schere in die Eizelle wird unbedingt die Tipps halten gegen die Innenseite des die Schale. Direkte das Blatt gegen die Basis und langsam beginnen, um die Schale geschnitten. entgegen dem Uhrzeigersinn um den bis kurz vor Erreichen der Spitze entfernt. Nehmen Sie die Schere und wiederholen Sie gehen in die entgegengesetzte Richtung, bis nur noch ein kleines Stück des Ei haften bleibt. Überprüfen Sie, ob das Ei befruchtet wird. Shut the window.
6. Closing, Wiedereröffnung und Abdichtung des Eies.
- Cut über ein 2-3 "lang und 1 / 2" breite Plastikband und schloss das Fenster so wieder passt in das Loch, das geschnitten wurde. Nehmen wir ein anderes 1 x 1 "Stück Klebeband und Siegel das Loch, aus dem das Ei abgelassen wurde. Verwenden einer Pinzette, um das Ei zu Manipulationen zu tun öffnen. Wenn Sie bereit sind, um die Eier in den Inkubator zurück sind, schneiden Sie ein Stück der Band, das groß genug, um das Fenster zu versiegeln und decken die gesamte horizontale Fläche des Eies ist.
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Discussion
Diese Methode ermöglicht eine lange Überlebenszeit folgenden experimentellen Manipulationen. Zum Beispiel erlaubt Farbstoff-Kennzeichnung Studien Überleben E10 oder später in ein Schicksal, Mapping-Studie (1). Darüber hinaus hat es für in ovo Elektroporation Studien, die Veränderung der Genexpression und Entwicklung erforderlich, um zu späteren Entwicklungsstadien (2-6) weiter verfahren werden eingesetzt. Diese Fenstertechnik können in Kombination mit jedem Verfahren, das Überleben nach Manipulationen am Embryo braucht eingesetzt werden.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
- Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).
- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
