Summary
Het gemak van bereikbaarheid van het embryo heeft het mogelijk gemaakt voor experimenten naar cel lot met behulp van verschillende methoden, waaronder chick kwartel hersenschimmen en focale kleurstof etikettering kaart. In dit artikel tonen we een ei voorbereiding methode die is geoptimaliseerd voor een lange overlevingsduur.
Abstract
De studie van de ontwikkeling is sterk ondersteund door het gebruik van het kippenembryo als een experimenteel model. Het gemak van bereikbaarheid van het embryo heeft het mogelijk gemaakt voor experimenten naar cel lot met behulp van verschillende methoden, waaronder chick kwartel hersenschimmen en focale kleurstof etikettering kaart. Daarnaast, is het mogelijk voor moleculaire verstoringen van verschillende types, waaronder de plaatsing van eiwit-gecoate kralen en introductie van plasmide DNA met behulp van in-ovo elektroporatie. Deze experimenten hebben opgeleverd belangrijke gegevens over de ontwikkeling van het centrale en perifere zenuwstelsel. Voor veel van deze studies, is het noodzakelijk om de eischaal te openen en te hersluiten zonder verstoren van de embryo's groei. Het embryo kan worden onderzocht in opeenvolgende ontwikkelingsfasen door de heropening van de eierschaal. Terwijl er verschillende uitstekende methoden voor het openen van kippeneieren, in dit artikel tonen we aan een methode die is geoptimaliseerd voor lange tijd te overleven. In deze methode, het ei rust op zijn kant en een klein venster wordt gesneden in de schaal. Na de experimentele procedure, wordt de shell gebruikt om het ei voor de duur van zijn ontwikkeling te dekken. Doorzichtige plastic tape bedekken de eierschaal beschermt de embryo en het behoud van hydratatie gedurende de rest van de incubatietijd. Deze methode is gebruikt vanaf twee dagen van incubatie en heeft toegestaan overleving door volwassen embryonale leeftijden.
Protocol
1. Verwijder de eieren van incubator
- Te handhaven op 37 ° C met een relatieve luchtvochtigheid die boven de 60%.
- Verwijder de eieren, sla de eieren 90 °, zodat de grote basis horizontaal ligt.
2. Wattenstaafje eieren om te steriliseren
- Verzadigen een stapel van niet-steriel gaasje met 70% ethanol.
- Gebruik twee tot drie stukken op te uitstrijkje tot 5 eieren. Gooi als het gaas vuil is.
3. Voorbereiden eiwit verwijderen website
- Knippen en plaats een 1 "x 1" stukje plastic tape 3M net links van de basis om het gebied waar de albumine zullen worden getrokken uit te beschermen.
4. Verwijdering van albumine
- Gebruik de punt van een schaar om een klein gat in het midden van de tape.
- Met behulp van een 10 cc spuit met een 18-gauge, 1-inch naald langzaam boren de naald door het gat van de schaar.
- Rij de naald neer op een hoek van 45 ° C naar de onderkant van het ei.
- Kantel de naald richting het centrum en het opstellen van 3-4 mL van eiwit.
5. Window
- Snijd een 3 "x 3" stukje plastic tape en rek het te passen op de top van het ei. Uitbreiding van de hoeken van het plein rond de afgeronde uiteinden van de horizontale oppervlakte van de eieren, zorg dat u trekken te hard. Trek de tape, zodat deze strak tegen het oppervlak van de eieren zonder plooien.
- Met behulp van een paar scherpe rechte 4 "dissectie schaar, draai een gat in de onderkant midden van het gebied waar de tape is geplaatst. Langzaam het onderste blad van de schaar gids in het ei en zorg ervoor om de tips te houden tegen de binnenkant van de schelp. Direct het blad naar de basis en langzaam beginnen de shell te snijden. Voorwaarts in een tegen de klok mode, stoppen net voor het bereiken van de top centrum. Verwijder de schaar en herhaal gaan in de tegenovergestelde richting totdat er slechts een klein stukje van de ei verbonden blijft. Controleer of het ei wordt bevrucht. Sluit het venster.
6. Sluiten, heropenen en het afdichten van de ei.
- Snijd ongeveer een 2-3 "lang en 1 / 2" breed plastic tape en sloot het raam, zodat het past weer in het gat dat werd gesneden. Neem een ander 1 x een "stuk tape en zegel het gat waar het ei werd afgevoerd. Gebruik een pincet om het ei op een manipulatie te doen heropenen. Wanneer u klaar bent om de eieren terug te keren naar de incubator, snijd een stuk van de tape die groot genoeg is om het venster te verzegelen en de hele horizontale oppervlak van het ei te dekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode zorgt voor lange tijd te overleven volgende experimentele manipulaties. Bijvoorbeeld, dye-labeling studies mogen voortbestaan aan E10 of later in een lot mapping studie (1). Daarnaast is het gebruikt voor in ovo elektroporatie studies dat verandering van de genexpressie niveaus en benodigde ontwikkeling door te gaan naar latere ontwikkelingsstadia (2-6) te verstrekken. Dit window techniek kan gebruikt worden in combinatie met een procedure die overleving na manipulaties aan het embryo vereist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
- Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).
- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
