Summary
La facilité d'accès de l'embryon a permis de cartographier les expériences destinées cellulaires en utilisant plusieurs méthodes, y compris les poussins de caille chimères et d'étiquetage de teinture focale. Dans cet article, nous démontrons une méthode de préparation d'oeuf qui a été optimisé pour les temps de survie longue.
Abstract
L'étude du développement a été grandement facilitée par l'utilisation de l'embryon de poulet comme modèle expérimental. La facilité d'accès de l'embryon a permis de cartographier les expériences destinées cellulaires en utilisant plusieurs méthodes, y compris les poussins de caille chimères et d'étiquetage de teinture focale. En outre, il permet de perturbations moléculaires de plusieurs types, y compris le placement de protéines billes recouvertes et l'introduction d'ADN plasmidique en utilisant l'électroporation in ovo. Ces expériences ont fourni des données importantes sur le développement des systèmes nerveux central et périphérique. Pour beaucoup de ces études, il est nécessaire d'ouvrir la coquille et se refermer sans perturber la croissance de l'embryon. L'embryon peut être examiné à étapes successives de développement par la réouverture de la coquille. Bien qu'il existe plusieurs excellentes méthodes pour l'ouverture des oeufs de poule, dans cet article, nous démontrons une méthode qui a été optimisé pour les durées de survie longue. Dans cette méthode, l'œuf repose sur son côté et une petite fenêtre est coupé dans la coquille. Après la procédure expérimentale, le shell est utilisé pour couvrir l'œuf pour la durée de son développement. Effacer ruban de plastique recouvrant la coquille protège l'embryon et aide à retenir l'hydratation pendant le reste de la période d'incubation. Cette méthode a été utilisée à partir de deux jours d'incubation et a permis la survie à travers les âges mûrs embryonnaire.
Protocol
1. Retirer les oeufs de l'incubateur
- Maintenir à 37 ° C avec une humidité relative de 60% fixé au-dessus.
- Retirer les oeufs, tourner les œufs à 90 ° de telle sorte que la grande base est horizontale.
2. Swab pour stériliser les oeufs
- Saturer une pile de gaze non stérile avec de l'éthanol à 70%.
- Utilisez deux à trois pièces au coton-tige à 5 œufs. Jeter lors de la gaze est sale.
3. Préparation du site retrait albumine
- Couper et placer un 1 "x 1" morceau de ruban adhésif 3M juste à gauche de la base afin de protéger la zone où l'albumine sera tirée.
4. Suppression de l'albumine
- Utilisez le point d'une paire de ciseaux pour faire un petit trou dans le milieu de la bande.
- En utilisant une seringue de 10 cc avec une jauge de 18, 1 pouces aiguille, lentement forage l'aiguille dans le trou fait par les ciseaux.
- Disque de l'aiguille à un angle de 45 ° C vers le bas de l'œuf.
- Inclinez l'aiguille vers le centre et dresser 3 à 4 ml d'albumine.
5. Fenêtrage
- Coupez un 3 "x 3" morceau de ruban de plastique et l'étirer pour tenir sur le sommet de l'œuf. Étendre les coins de la place autour des extrémités arrondies de la surface horizontale des œufs, en faisant attention à ne pas tirer trop fort. Tirez sur la bande de sorte qu'il est bien serré contre la surface des œufs sans plis.
- En utilisant une paire d'arêtes droites 4 ciseaux de dissection ", tordre un trou dans le centre du fond de la zone où la bande a été placée. Lentement guider la lame inférieure des ciseaux dans l'oeuf étant sûr de garder les astuces contre l'intérieur de le shell. directe de la lame vers le bas et lentement commencer à couper la coquille. Procéder de façon anti-horaire, s'arrêtant juste avant d'atteindre le haut au centre. Enlever la paire de ciseaux et répétez va dans le sens opposé jusqu'à ce que seul un petit peu de la oeuf reste attaché. Vérifiez que l'ovule est fécondé. Fermez la fenêtre.
6. Fermeture, de réouverture et d'étanchéité de l'œuf.
- Coupez environ un 2-3 "de long par 1 / 2" ruban adhésif large et fermer la fenêtre pour qu'elle s'ajuste dans le trou qui a été coupé. Prenez un autre de 1 x 1 "morceau de ruban adhésif et sceller le trou par lequel l'œuf a été drainé. Utilisez une pince à rouvrir l'œuf pour faire toutes les manipulations. Lorsque vous êtes prêt à retourner les œufs dans l'incubateur, couper un morceau de la bande qui est assez grande pour sceller les fenêtres et couvrir toute la surface horizontale de l'œuf.
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Discussion
Cette méthode permet des temps de survie à long suivantes manipulations expérimentales. Par exemple, la teinture-étiquetage études ont permis la survie à E10 ou tard dans une étude de la cartographie sort (1). En outre, il a été utilisé pour des études électroporation in ovo qui fournissent l'altération des niveaux d'expression des gènes et de développement requis pour procéder à des étapes ultérieures de développement (2-6). Cette technique de fenêtrage peut être utilisé en combinaison avec une procédure qui nécessite de survie après des manipulations de l'embryon.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
- Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).
- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
