Размещение фактор роста покрытием бисер на ранних эмбрионов куриного этап

Summary

Различные факторы роста и белки взаимодействуют, чтобы побудить клетки взять на себя разные судьбы клетка в процессе разработки. Здесь мы показываем, использование в ово подготовки к устранению возможных взаимодействий между различными белками в развитии путем размещения бусины на E2.5 куриных эмбрионов.

Abstract

Нервной трубки выражает многие белки в конкретных пространственно-временных моделей в процессе разработки. Эти белки, как было показано иметь решающее значение для сотовых судьба решимость, миграции клеток и формирования нейронных цепей. Нейронные индукции и структурирование привлекать костные морфогенетические белки (BMP), звуковой еж (SHH), фактор роста фибробластов (FGF), среди других. В частности, выражение структуры Fgf8 находится в непосредственной близости к регионам выражения BMP4 и SHH. Это выражение же ситуация наблюдается и с отклонениями в развитии взаимодействия, которые облегчают структурирование в конечном мозге.

Здесь мы предлагаем наглядной демонстрации метода, в котором в ово препарат может быть использован для тестирования эффектов FGFs в формировании переднего мозга. Бусины покрыты белком и помещен в развивающихся нервной трубки оказывать постоянную экспозицию. Поскольку процедура использует маленькие, тщательно помещены шарики, это минимально инвазивный и позволяет несколько бусин, чтобы быть размещены в пределах одной нервной трубки. Более того, метод позволяет в постоянном развитии, так что эмбрионы могут быть проанализированы на более зрелой стадии, чтобы обнаружить изменения в анатомии и в нейронных кучность стрельбы. Этот простой, но полезный протокол позволяет в режиме реального времени изображения. Он обеспечивает средства, чтобы во времени и пространстве ограниченных изменений к эндогенным белка.

Protocol

1. Удалить яйца из инкубатора

На E2-2.5 (~ 17 Санкт-НН), удалить яйца и готовить их соответствующим образом. Они могут быть разработаны сразу же или возвращен в инкубаторе в течение нескольких часов. Яйца могут быть размещены при комнатной температуре безопасно в течение часа. Яйца могут оставаться в течение всего срока манипуляций. Иногда это может занять час или более.

Примечание: Чем дольше они сидят при комнатной температуре, тем меньше шансов, что они, чтобы выжить.

2. Подготовка тушь

1. Подготовка свежего раствора 4% тушь в стерильном PBS.
2. Заполните 3 мл шприц с раствором.
3. Место 27 калибр, ½ дюйма иглу на шприц.
4. Используя пару hemostats, согните иглу под углом 90 °.

3. Открытие яйца и введения тушь

1. Используя пару щипцов, отогните ленту и открыть окно, закрепив его с помощью обратной стороне ленты на обратной стороне яйца.
2. Руководство в угловых иглу, пока она лежит прямо под эмбриона. Размещение иглы под плавающий диск гарантирует, что чернила, который является токсичным для эмбриона, не придет в непосредственном контакте.
3. Вам нужно только вводить достаточно чернил для создания комфортной контрастности. Это, как правило, менее ¼ мл.

4. Открытие нервной трубки

1. Возьмите пару тонких ножниц рассечение и нарезать тонкой мембраной, которая лежит сверху, а иногда и вокруг, эмбрион.
2. Возьмите пару из 55 щипцов или вольфрама зонда и открытой нервной трубки от задних к передним. Убедитесь, что открытие является достаточно большой, чтобы разместить в ней шарик.

Примечание: В зависимости от возраста, прекрасно вольфрамовый зонд может использоваться, чтобы сделать то же самое.

5. Получение покрытые гепарином акриловые бусины

1. Использование пары из 55 пинцетов, найти нетронутый бисер в растворе. Пусть шарик присоединится к кончику, медленно закройте щипцы.
2. Удалить шарик из раствора и перенести его на верхней части яйца.
3. Как только шарик из ее решения, это вряд ли отрываться, пока он был помещен в альбумин.

6. Размещение бусину

1. Как только шарик был размещен в верхней части целевой области, использование вольфрамового зонда направлять его на передний мозг или исправить его в задний мозг.
2. Добавить несколько капель PBS с использованием 10 мкл пипетки.

7. Закрытие яйцо

1. Закрыть яйцо использованием тонкий кусок ленты, чтобы закрыть окно.
2. Печать яйцо в соответствии с Prepping протокол, доступны на http://jove.com/index/Details.stp?ID=306 .

Discussion

В зависимости от белка вы хотите использовать, Существуют различные протоколы о том, как подготовить бисером. В этих экспериментах мы используем гепарин-акриловые бусины, но Аффи-гель бусины могут быть также использованы. Мы обнаружили, что гепарин-акриловые бусины легче манипулировать в водной среде яичного альбумина. Бисер замачивают в 5 л белка на ночь при 4 ° C. Управление бусины помещают в стерильную PBS до момента размещения. Преимущество использования в ово подготовки является то, что эмбрион еще живы и свободно развиваться нормально ^1. Хотя среда, в которой хранится эксплантов можно управлять для отдельных переменных, живой эмбрион обеспечивает точное представление аффект белка на развитие модели ^2-3. Все анализы, которые можно выполнять на эксплантов, вы можете с эмбрионом.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Eggs	Animal			Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH)
Incubator	Profi-I	Lyon
India Ink	Tool	Higgins		Prepare a 4% solution in sterile PBS.
Sterile PBS				Alternatively, an antibody cocktail can be used
1ml syringe
27G 1/2 needles	Tool	BD Biosciences	305109	Angled at 90 degrees
Forceps	Tool	World Precision Instruments, Inc.		size 55
Hemostats
Dissection scissors	Tool	World Precision Instruments, Inc.	500086	vannas, 8.5cm
Parafilm tape				to seal eggs
Tungsten Probe	Tool	Electron Microscopy Sciences	62091	Tool #24. Handle optional.