Summary
成長因子や様々なタンパク質は、開発中に別の細胞の運命を引き受ける細胞を誘導するために相互作用する。ここでは、E2.5のニワトリ胚にビーズを配置することにより、開発の異なるタンパク質間の相互作用の可能性に対処するためにOVO準備での使用を示します。
Abstract
神経管は、開発中に特定の時空間パターンで多くのタンパク質を発現する。これらのタンパク質は、細胞の運命決定、細胞移動、および神経回路の形成に重要であることが示されている。神経誘導とパターン形成は、骨形成タンパク質（BMP）、ソニックヘッジホッグ（SHH）、特に線維芽細胞増殖因子（FGF）を、含む。特に、FGF8の発現パターンは、BMP4およびSHHを発現している地域に近接している。この発現パターンは、終脳のパターン形成を促進する発達の相互作用と一致している。
ここでは、OVOの準備の前脳形成におけるFGFの効果をテストするために使用可能なメソッドの視覚的なデモンストレーションを提供しています。ビーズは、タンパク質でコーティングし、持続的な露出を提供するために開発し、神経管に配置されます。プロシージャが小さい、慎重に配置されたビーズを使用しているので、それは低侵襲であり、いくつかのビーズは、単一の神経管の中に配置することができます。また、この方法は、胚が解剖学および神経パターン形成の変化を検出するために、より成熟した段階で分析できるように継続的な開発が可能になります。この単純だが有用なプロトコルは、リアルタイムイメージングが可能になります。それは、内因性のタンパク質レベルに空間的かつ時間的に限られた変更を行う手段を提供します。
Protocol
1。インキュベーターから卵を取り除く
E2 - 2.5（〜聖17 HH）で、卵を削除し、それに応じてそれらを準備します。彼らはすぐに上に働いたり、数時間のためにインキュベーターに戻すことができます。卵は一時間以上にわたって安全に、室温で置くことができます。卵は操作の間、外滞在することができます。時には、これらは1時間以上かかる可能性が。
注 ：長い彼らは室温で座って、可能性は低く、彼らが生き残るためです。
2。インドインクの調製
- 滅菌PBS中4％、インドのインクの新鮮な溶液を調製します。
- 溶液で3 mLシリンジを埋める。
- 注射器で27ゲージ、½インチの針を置きます。
- 止血のペアを使用して、90 °の角度に針を曲げる。
3。墨汁の卵と注射を開く
- バックテープをはがし、ピンセットを使うと卵の裏面にテープの裏面を使用して、それを固定して、ウィンドウを開きます。
- それは単に胚の下にあるまで、斜めに針でガイド。フローティングディスクの下に針を置くことは、胚への毒性がインクは、、直接接触しないことが保証される。
- あなただけの快適なコントラストを作成するのに十分なインクを注入する必要があります。これは通常、¼ mLの未満です。
4。神経管を開く
- 細かい解剖ハサミを取ると上部にある薄い膜、または時々周り、胚をカット。
- 55ピンセットまたはタングステンプローブを取り、後方から前方に神経管を開きます。開口部がそれにビーズを配置するのに十分な大きさであることを確認してください。
注 ：年齢に応じて、微細なタングステンプローブが同じことを行うために使用することができます。
5。コーティングされたヘパリン-アクリルビーズを取得
- 55ピンセットを用いて、溶液中で完全なビーズを見つける。ビーズが先端に付着させ、徐々に鉗子を閉じてください。
- ソリューションからビーズを取り出して、卵の上にそれを引き入れる。
- ビーズは、その溶液からしたらそれはアルブミンに置かれるまで、それは可能性が高いから来ることはありません。
6。ビーズの配置
- ビーズは、ターゲット領域の上に配置されると、脳に向かってそれを導くか、後脳でそれを修正するタングステン探針を使用してください。
- 10μLピペットを用いてPBSを数滴を追加します。
7。卵を閉じる
- ウィンドウをシャットダウンするテープの薄い部分を使って卵を閉じます。
- で利用可能な準備中のプロトコルに従って卵、封印http://jove.com/index/Details.stp?ID=306を 。
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Discussion
使用したい蛋白質に応じて、ビーズを準備する方法の別のプロトコルがあります。これらの実験では、我々はヘパリン - アクリルビーズを使用しますが、アフィ - ゲルのビーズを使用することもできます。我々はヘパリン - アクリルビーズは、卵アルブミンの水溶液環境での操作が容易であることを見出した。ビーズは4℃で一晩タンパク質の5リットルに浸漬されていますコントロールビーズを配置するまで滅菌PBSに配置されます。 OVOの準備に使用する利点は、胚がまだ生きていると、通常は1を開発するために自由であるということです。外植片が保持される環境が特定の変数のために制御することもできますが、生きている胎児は発達パターン上のタンパク質2-3の影響を正確に表現することができます。すべてのアッセイでは、外植片に実行できることは、胚の場合とすることができます。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
