Summary
Uma variedade de fatores de crescimento e proteínas interagem para induzir as células a assumir os destinos diferentes de células durante o desenvolvimento. Aqui mostramos o uso de um ovo na preparação para enfrentar as possíveis interações entre diferentes proteínas no desenvolvimento, colocando contas em e2.5 embriões de galinha.
Abstract
O tubo neural expressa em muitas proteínas específicas padrões espaço-temporais durante o desenvolvimento. Essas proteínas foram mostrados para ser crítico para a determinação de célula destino, migração celular e formação de circuitos neurais. Indução neuronal e padronização envolvem proteína morfogenética óssea (BMP), sonic hedgehog (SHH), fator de crescimento fibroblástico (FGF), entre outros. Em particular, o padrão de expressão de Fgf8 está em estreita proximidade com regiões expressar BMP4 e SHH. Este padrão de expressão é consistente com interações de desenvolvimento que facilitam a padronização no telencéfalo.
Aqui nós fornecemos uma demonstração visual de um método em que um ovo em preparação pode ser usado para testar os efeitos de fgfs na formação do cérebro anterior. Grânulos são revestidos com proteína e colocado no tubo neural em desenvolvimento para oferecer a exposição sustentado. Porque o procedimento utiliza pequenas, miçangas cuidadosamente colocados, é minimamente invasivo e permite várias contas para ser colocado dentro de um único tubo neural. Além disso, o método permite o desenvolvimento contínuo de modo que os embriões podem ser analisados em um estágio mais maduro para detectar alterações na anatomia e na padronização neural. Este protocolo simples, mas útil permite a visualização em tempo real. Ele fornece um meio de fazer mudanças espacialmente e temporalmente limitado a níveis de proteína endógena.
Protocol
1. Retire os ovos da incubadora
Na E2-2.5 (~ 17 St. HH), retire os ovos e prepará-los adequadamente. Eles podem ser trabalhadas imediatamente ou voltou para a incubadora por algumas horas. Os ovos podem ser colocados em temperatura ambiente com segurança por mais de uma hora. Os ovos podem ficar de fora para a duração das manipulações. Às vezes, estes podem levar uma hora ou mais.
Nota: Quanto mais tempo eles ficam em temperatura ambiente, menos provável é que eles são para sobreviver.
2. Preparação de nanquim
- Prepare uma nova solução de 4% de tinta Índia em PBS estéril.
- Encher uma seringa de 3 mL com a solução.
- Coloque uma agulha calibre 27 ½ polegada, na seringa.
- Usando um par de hemostats, dobre a agulha a um ângulo de 90 °.
3. Abrindo os ovos e injeção de nanquim
- Usando um par de fórceps, descascar a fita e abrir a janela, prendendo-o usando o verso da fita na parte de trás do ovo.
- Guia na agulha em ângulo até que se encontra logo abaixo do embrião. Colocar a agulha sob a disco flutuante assegura que a tinta, que é tóxico para o embrião, não entram em contacto directo.
- Você precisa apenas injetar tinta suficiente para criar um contraste confortável. Este é normalmente inferior a ¼ mL.
4. Abertura do tubo neural
- Pegue uma tesoura de dissecção fina e cortar a fina membrana que fica na parte superior, ou às vezes por aí, o embrião.
- Pegue um par de 55 fórceps ou uma sonda de tungstênio e abrir o tubo neural de posterior para anterior. Certifique-se que a abertura é grande o suficiente para colocar um cordão para ele.
Nota: Dependendo da idade, uma sonda de tungstênio fino pode ser usado para fazer a mesma coisa.
5. Recuperando um revestimento de heparina em acrílico talão
- Usando um par de fórceps 55, encontrar uma pérola intacta na solução. Deixe o talão juntar-se para a ponta, lentamente fechar a fórceps.
- Remover o talão da solução e trazê-lo mais em cima do ovo.
- Uma vez que o cordão está fora de sua solução, ela provavelmente não vai sair até que tenha sido colocado no albumina.
6. Colocar o talão
- Uma vez que o talão tenha sido colocada em cima da área-alvo, use uma sonda de tungstênio para guiá-la para o cérebro anterior ou corrigi-lo no rombencéfalo.
- Adicione algumas gotas de PBS com uma pipeta de 10 mL.
7. Fechando o ovo
- Feche o ovo usando o pedaço fino de fita para fechar a janela.
- Selo do ovo de acordo com o protocolo preparando, disponível em http://jove.com/index/Details.stp?ID=306 .
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Discussion
Dependendo da proteína que você deseja utilizar, existem diferentes protocolos sobre como preparar as contas. Nesses experimentos, usamos heparina em acrílico contas, mas Affi-gel contas também pode ser usado. Descobrimos que as contas heparina em acrílico são mais fáceis de manipular no ambiente aquoso do ovo albumina. Grânulos são embebidos em 5 l de proteína durante a noite a 4 ° C. Esferas de controlo são colocados em PBS estéril até o momento da colocação. A vantagem de usar um ovo na preparação é que o embrião ainda está vivo e livre para se desenvolver normalmente 1. Embora o ambiente no qual um explante é mantida pode ser controlado para variáveis particular, o embrião vivo permite uma representação precisa do afeto de uma proteína em padrões de desenvolvimento 2-3. Todos os ensaios que você pode executar em um explante, é possível com um embrião.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
