Summary
Tregs son supresores potentes del sistema inmune. Hay una falta de marcadores de superficie única para definir, por lo tanto, las definiciones de células T reguladoras son principalmente funcionales. A continuación se describe un optimizado
Abstract
Las células T reguladoras (Tregs) son mediadores críticos de la tolerancia inmunológica a antígenos propios. Además, son reguladores esenciales de la respuesta inmune después de una infección. A pesar de los esfuerzos para identificar marcadores de superficie única en Tregs, la única característica única es su capacidad para suprimir la proliferación y la función de las células T efectoras. Si bien es claro que sólo en los ensayos in vitro se pueden utilizar en la evaluación de la función Treg humanos, esto se vuelve problemático cuando se evalúen los resultados de los estudios transversales en las células sanas y células aisladas de pacientes con enfermedades autoinmunes (como la diabetes tipo 1-DT1) necesitan para ser comparados. Hay una gran variabilidad entre laboratorios en el número y tipo de células T de respuesta, la naturaleza y la fuerza de la estimulación, Treg: ratios de respuesta y el número y tipo de células presentadoras de antígeno (APC) que se utiliza en humanos en ensayos de supresión in vitro. Esta variabilidad hace que la comparación entre los estudios de medición de la función Treg difícil. El campo de las necesidades de Treg un ensayo de supresión estándar que funcione bien con los sujetos sanos y aquellos con enfermedades autoinmunes. Hemos desarrollado un ensayo de supresión in vitro que muestran muy poca variabilidad intra-ensayo en la estimulación de células T aisladas de voluntarios sanos en comparación con sujetos con base destrucción autoinmune de las células pancreáticas β-. El objetivo principal de esta obra es describir un ensayo in vitro supresión humanos que permita la comparación entre grupos de sujetos diferentes. Además, este ensayo tiene el potencial para delinear una pequeña pérdida en la función nTreg y anticiparse a una mayor pérdida en el futuro, por lo tanto la identificación de los sujetos que podrían beneficiarse de la terapia inmunomoduladora preventivas 1. A continuación, ofrecemos una descripción detallada de los pasos involucrados en este procedimiento. Esperamos contribuir a la estandarización de la prueba de supresión in vitro utilizado para medir la función Treg. Además, le ofrecemos este ensayo como una herramienta para reconocer un estado inicial de desequilibrio inmunológico y un biomarcador potencial funcional de DT1.
Protocol
1. Antes de la creación de un ensayo de supresión, es necesario cuentas de abrigo tosylactivated con anti-CD3 humano (clon UCHT1, 1μg/ml concentración final) para la estimulación de células y después comprobar si las cuentas están recubiertas de manera eficiente mediante la creación de un ensayo in vitro de la proliferación de uso humano las células T
- Tomar 1 ml de M-450 cuentas de tosylactivated vial original, lugar en soporte magnético y espera hasta que todas las cuentas se han adherido a la pared del tubo. Retire el tubo de amortiguación, mientras que todavía está en el soporte magnético. Tome el tubo del soporte magnético y añadir 1 ml de buffer1, colocar el tubo en soporte magnético y retire el tubo de buffer1 mientras está en el soporte magnético, cuentas resuspender en 1 ml de buffer1 y añadir 40μl de anti-CD3 humano, agitando a 37 º C durante 15 minutos, añadir 0,1% w / v BSA y continuar agitando durante 16 horas siguientes.
- Lavado de los granos en buffer2 dos veces durante 5 minutos a 2-8 ° C y una vez en buffer3 durante 5 minutos a 2-8 ° C con soporte magnético como se explicó anteriormente, quitar el tampón y volver a suspender las bolas en 1 ml de buffer2, las cuentas son 4x10 8 / ml concentración final y listo para usar.
- Alícuota de 50.000 y 25.000 PBMC / y por triplicado en una placa de 96 pocillos y añadir un número variable de CD3 revestida de piedras (4x10 8 cuentas / ml, CD3 1μg/ml, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 gotas / celular ) con el fin de determinar el número óptimo de cuentas por celda. Después de 72 horas en cultivo, añadir 1μCi [3H]-timidina y continuar la incubación a 37 ° C durante las 16 horas siguientes. Las células de la cosecha en la placa de la cosecha multipantalla (Millipore), añadir líquido de centelleo y leer cuentas por minuto (cpm) / y con mejores NXT Count (Packard, CT). Use las gotas / proporción de células en CPM están por encima de 5000, pero 15.000 menos que para evitar la sobre-estimulación de células T reguladoras, que podrían perder la función supresora. Por lo general, la proporción de 3 bolas / celular estimula la respuesta y las células T reguladoras en todos los grupos sometidos a prueba hasta el momento 1-4.
2. PBMC aislamiento de toda la sangre de donantes sanos o de leukopacks humanos o de la capa leucocitaria (BC) por lo general tomado de voluntarios sanos y disponibles de forma gratuita desde los Centros de Transfusión de Sangre (Figura 1)
- Diluir la AC (~ 50 ml) 1:06 con PBS (añadir 250 ml). Ahora no es el volumen total de 300ml. Poco a poco la capa de 25ml de BC diluida en la parte superior de 15 ml de Ficoll-Paque PLUS añadido a 50 ml tubos Falcon, sin alterar las capas. Centrifugar a 800xg (1400 rpm en una centrífuga Sorvall con rotor basculante SH-3000) durante 30 minutos a 4 ° C, con frenos de apagado.
- Recoger cuidadosamente la capa de PBMC (fase intermedia) y la transferencia a un nuevo máximo de 50 ml tubos Falcon. Lávese las PBMC mediante la cumplimentación de los tubos hasta 50 ml con DPBS. Recoger 2 gránulos de las células en un tubo. Centrifugar a 400xg durante 10 min a 4 ° C. Repita la etapa de lavado dos veces, cada vez que la combinación de 2 gránulos de las células en un solo tubo. Combine todos los gránulos de las células en un solo tubo de 50 ml.
- Contar con PBMC usando Trypan exclusión de prueba azul. Hacer una dilución 1:10 en azul tripán añadiendo 20μl de PBMC a 180μl de azul de tripano mancha. Mezclar bien y tomar 20μl a contar en hemocitómetro de inmediato. Contar el número de todas las células teñidas de azul y sin mancha y está ubicado en dos manzanas cada uno con 16 plazas más pequeñas. Tomar la media de ambas y se multiplica por 10. Divida este número por 100 para obtener el número de PBMC / ml. Porcentaje de células viables calcular como [1 - (número de células de color azul / número de células totales) x 100]. Proceder en caso de viabilidad es ≥ 95%.
3. MACS pre-tipo de células T CD4
- Antes de continuar, la transferencia de 1 ml de PBMC en un nuevo tubo, añadir 4 ml de los medios de comunicación para preparar a las células de la irradiación con 5000rad-estos serán células presentadoras de antígeno (APC).
- Centrifugar el resto de las células en 250xg en PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA durante 10 min a 4 ° C. Retirar las células sobrenadante y resuspender en 4 ml de buffer PBS/2mM EDTA/0.5% BSA.
- Agregar 200μl de MACS microbolas anti-CD4 e incubar a 4 ° C durante 20 minutos.
- Lave mediante la adición de 40 ml de buffer PBS/2mM EDTA/0.5% BSA y centrifugar a 250xg durante 10 minutos a 4 ° C. Elimínese el líquido sobrenadante y resuspender en 8 ml de desgasificado, la temperatura ambiente PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA.
- Filtro por separado la suspensión de células con separación de Pre-filtros antes de su carga en una columna de LS.
- Dividir la suspensión celular y la capa de 4 ml cada columna LS más de calibrado (con 3 ml de deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA). LS columna se fija en el separador MidiMACS. Antes de la suspensión celular se agota, o bien volver a ejecutar el caudal contínuo o añadir 3 ml de la temperatura ambiente deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA y dejar que el buffer que se recorra. Agregar más buffer hasta que salga clara.
- Pipeta de 5 ml de búfer deggassed en la columna LS, LS eliminar la columna del separador MidiMACS y el lugar en un nuevo tubo estéril de recogida 15ml dejar correr ~ 1.0 ml a través. Poner el pistón en la columna y empuje lentamente el resto de lavolumen fuera.
- Haga lo mismo con las dos columnas LS y combinar las dos fracciones de células CD4 +. Agregue hasta 50 ml de PBS las células y el recuento. Rendimiento esperado es de hasta 5x10 8 células. Centrifugar a 400xg durante 10 minutos y suspender las células en 2 ml y PBS/2mM EDTA/0.5% de tampón BSA.
4. Fluorescentes clasificación de células activadas (FACS) de aislamiento (Figura 2)
- Hacer un cóctel de anticuerpos a los marcadores de CD a los siguientes marcadores de superficie celular (mantener protegido de la luz): 20 l de anti-humano CD8-FITC (clon del EPR-T8), 20 l de anti-CD14 humano-FITC (clon M5E2; receptor de LPS), 20 l de anti-CD32 humano-FITC (clon FLI8.26; FcγR de tipo II) y 6 l de anti-CD116 humana-FITC (clon M5D12, GM-CSFRα cadena) y, en su defecto, añadir 40μl contra -CD4 humano APCCy7 (clon RPA-T4).
- Tome 5μl de la suspensión celular y se tiñen con 2 ml de cóctel 2μl mancha, lo que es un tubo para determinar el umbral (Fluorocromo Minus One FMO) 5.
- Añadir 50 l de anti-CD25 humano-PE (clon M-A251, IL-2Rα) para el cóctel de la mancha, y añadir el cóctel de suspensión de células y se incuba a 4 ° C 30 minutos. Lavar las células en tampón PBS, centrifugar a 400xg durante 10 minutos y suspender las células a una concentración de 10 7 células / ml.
- Prepare las células y las células no teñidas o cuentas teñidas con un solo fluorocromo para su uso como control de compensación de clasificación de células en FACS Aria (BD Biosciences, San José, NJ).
- Adquirir las células en el tubo de FMO, que permitirá al usuario establecer el umbral para la clasificación de células CD25 + T (Figura 2a). Establecer una puerta alrededor de FITC células negativas para excluir FITC de células positivas que comprende los monocitos, los macrófagos y los linfocitos CD4 + otros-no de las células T (Figura 2b).
- En un gráfico diferente, dibuja puertas para CD25, CD25low y CD25high células T Tregs (1% de las células que expresan el mayor número de CD25) (Figura 2c). Subconjuntos de células suelen mostrar alta pureza (Figura 2d, 2e y 2f).
- Centrifugar los tubos de recogida de las células en 400xg durante 10 minutos y mantenerse en hielo hasta placas.
5. Establecer el cultivo de células en placa de 96 pocillos (esquema adjunto como Tabla 1) en 200μl/well
- 50μl alícuota de CD3 revestida de piedras (1 mg / ml), calculado a 3 perlas / células de respuesta en un pozo, se resuspendieron en medio completo con agregados de 10% de suero humano AB en el fondo en U 96 y placas. (Por ejemplo, para hacer que los medios de comunicación de 2 ml con CD3 recubierto, tomar 7.5μl de stock de CD3 revestida de piedras de final de la concentración de 4x10 8 / ml y se diluye en 2 ml de los medios de comunicación, cada 50μl contendrá 75.000 beads-3beads/cell).
- Diluir APC irradiado a la concentración celular de 5x10 5 / ml y añadir 50μl (contendrá 2,5 x 10 4 células) en cada pocillo con el estímulo añadido previamente, incluidos los pozos etiquetados como "células T reguladoras sólo", "APC sólo" y "medios de comunicación sólo" en la tabla 1.
- Añadir 2,5 x 10 4 / así CD4CD25-o las células T CD4CD25low por triplicado siguiendo el diseño en la Tabla 1.
- Añadir Tregs de co-cultivos (fila B, Tabla 1) en la proporción de 1:10 (2500 células Treg) y los pozos de la etiqueta "sólo Tregs" e incubar la placa a 37 ° C en la incubadora de CO 2 con un 5% de CO 2 , en la humedad saturada durante 72 horas.
- Pulso de los pozos con 1μCi [3H]-timidina y continuar la incubación a 37 ° C durante 16 horas siguientes.
6. La recolección y conteo
- Las células de la cosecha en la placa de la cosecha multipantalla con Packard Filtermate cosechadora o un sistema alternativo.
- Añadir líquido de centelleo (Microscint 20), cubrir la cosecha plato con cubierta de plástico transparente en la preparación para el paso final.
- Lea cuentas por minuto (cpm) / y con mejores NXT Count (Packard, CT) o un sistema alternativo.
7. Informática porcentaje de supresión
- Como las células se cultivaron por triplicado, el promedio se calcula para cada condición. Si el coeficiente de variación es> 30%, el valor atípico es eliminado y cpm sólo a partir de dos pozos se promedian. Porcentaje de la supresión se obtiene calculando [(sc) / s] x 100%, donde s = cpm en la cultura única y c = cpm en co-cultivo.
- Como ingenuo (CD25) e in vivo activado (CD25low) las células T efectoras se colocan como células T de respuesta, la diferencia en la capacidad de células T reguladoras para suprimir cada uno de estos subconjuntos es capturado y utilizado como un indicador pronóstico potencial funcional basado en la premisa que las células activadas son más difíciles de suprimir.
8. Los resultados representativos:
Una gran variabilidad en los métodos utilizados y los resultados derivados del análisis in vitro de la supresión humanos nos llevó a realizar un estudio exhaustivo de las condiciones que influyen en el ensayo 1. Hemos desarrollado un ensayo que prueba no sólo la función Treg, sino también su pureza, teniendo en cuenta la baja relación entre Tregs: Teffs (1:10), que determinó anteriormente 6. Además, se diferencian en células T reguladoras ªEIR capacidad de reprimir con éxito ingenuo e in vivo de células T activadas, incluso en sujetos sanos, como se muestra en la Figura 3 y en nuestros estudios anteriores 2,4, que se vuelve más importante si el balance inmunológico está comprometido, al igual que en los sujetos con riesgo de desarrollar DT1 . La prueba funcionó muy bien en el estudio donde se comparó la función supresora de los recursos naturales (nTregs), inducible (iTregs) e in vitro nTregs ampliado, lo que nos permite comparar su función entre los controles sanos, de reciente aparición (RO) DT1 y larga (LS ) sujetos DT1. Llegamos a la conclusión de que los sujetos RO DT1 mejor que la capacidad de generar tanto funcional iTregs nTregs y ampliado en comparación con sujetos de control LS T1D y sano 7. Por lo tanto, este ensayo puede ser utilizado como una herramienta excelente en el reconocimiento tanto de un estado temprano y tardío de un desequilibrio inmunológico.
Esquema 1 Presentación esquemática de los pasos involucrados en la represión en el ensayo in vitro
Figura 1. Pasos del ensayo de supresión in vitro presentados con fotografías
Figura 2. Estrategia de apertura de puerta en el aislamiento de células FACS. a) CD25 umbral + se ajustó de acuerdo a Fluorocromo Minus One (FMO), b) las células fueron cerradas como FITC-negativos, c) FITC-negativos células fueron aún más cerrada y se recoge en CD + CD25, CD + CD25low y CD + CD25high ( Tregs) se muestra con porcentajes, d) FACS ordenados Tregs después de la clasificación, e) FACS ordenados CD + CD25low después de la clasificación, y f) FACS ordenados CD4 + CD25 de las células T después de la clasificación
Figura 3. Los resultados representativos de los sujetos sanos a) Los resultados representativos de cuentas por minuto (cpm) de los sujetos sanos presentan como un solo cultivo para todos los subconjuntos de células implicadas (ingenuo-CD25-en vivo-activa CD25low, células presentadoras de antígeno-APC y regulación de las células T-Treg), así como co-cultivos de células T de respuesta (CD25-o CD25low) y células T reguladoras. b) El porcentaje de supresión de cada uno de CD25-y CD25low respuesta por las células T autólogas Tregs se presenta para los controles sanos (n = 4). Supresión se calcula como [(sc) / s] x 100%, donde s = cpm en la cultura única y c = cpm en co-cultivo. Aunque ligera diferencia en la capacidad de las células T reguladoras para suprimir la respuesta de células T se dio cuenta, no fue significativa (prueba t pareada p = 0,08). C) Se presentan cpm en temas de riesgo de cada cultura individual, incluyendo CD25-y CD25low como respuesta las células T, así como APC y Tregs, y co-culturas donde se siembra cada subconjunto de respuesta de células T con células T reguladoras (CD25-/Tregs y CD25low/Tregs). d) Porcentaje de la supresión de cada uno de CD25-y las células T de respuesta CD25low autólogo Tregs se presenta en sujetos de riesgo (n = 4). La diferencia en la capacidad de las células T reguladoras para suprimir CD25-en comparación con las células T CD25low respuesta fue significativa (prueba t pareada p = 0,04).
Tabla 1. Esquema de puesta en marcha de ensayo de supresión in vitro
| 1.3 | 6.4 | 9.7 | 10-12 | |
| A | CD4CD25- | CD4CD25low | los medios de comunicación sólo | los medios de comunicación sólo |
| B | CD4CD25-/ Tregs | CD4CD25low / Tregs | Tregs sólo | APC sólo |
| C | ||||
| D | ||||
| E | ||||
| F | ||||
| G | ||||
| H |
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Discussion
Como la única característica única de células T reguladoras, la función de supresión debe ser probado de forma fiable y uniforme entre los sujetos en las diferentes fases de desarrollo de la enfermedad dentro de la misma y entre los diferentes estudios. Le ofrecemos los detalles de la prueba de supresión desarrollado en nuestro laboratorio como nuestra contribución a la normalización de este ensayo. En nuestro estudio de optimización extensa, hemos determinado que la estimulación de células T con anti-CD3 humana revestida de piedras (UCHT1 clon, en la concentración de 1μg/ml (a diferencia de 5μg/ml disponibles en el mercado) en combinación con PBMC como APC proporciona la estimulación natural capaz de activar y de respuesta, tanto las células T y células T reguladoras en los sujetos estudiados 1. La elección del anticuerpo anti-CD3 humano es de gran importancia, ya que en nuestras manos, sólo los anticuerpos Ancell dio los resultados esperados. estimulación simultánea con anti-CD3 humanos y anti- CD28 humano no fue suficiente para detectar diferencias entre grupos de sujetos (los resultados no se muestra), mientras que PBMC ofrece una completa paleta de señales co-estimuladoras, aumentando la posibilidad de transducción de señales y estímulos eficaces.
Este protocolo se puede utilizar tanto con leukopacks y la sangre del paciente. La única diferencia es la cantidad de sangre que necesita ser cargado en la parte superior de la Ficoll-Paque PLUS en el procedimiento de aislamiento de PBMC. Los medios utilizados en este ensayo contiene un 10% combinado suero humano AB, que nos decidimos a ser una gran adición para el ensayo. Sin embargo, antes de ser utilizado, el suero tiene que hacerse la prueba de la capacidad de activar PBMC en su PBMC propias semillas (en sixplicate y añadir medio RPMI completo con el suero de edad, sin suero y con un nuevo suero. Después de 72 horas, el pulso placa, incubar 16 horas adicionales a 37 ° C, las células de la cosecha y obtener lecturas cpm). El aumento de cpm PBMC cultivadas con nuevo suero no es buen resultado y sugiere la necesidad de un suero con nuevo número de lote.
Hemos determinado que MACS clasificación hace manualmente con una columna LS para cada muestra ofrece rendimiento considerable mejor de células CD4 + T en comparación con Automax. Además, la pureza Treg se determinó que era> 95%, a juzgar por la expresión de CD25 (Figura 2d), la falta de proliferación in vitro (Figura 3a), el alto potencial de supresión en sujetos sanos en una relación de 01:10 entre Treg: respondedores ( Figura 3ab) y la más alta expresión de Foxp3 aislados entre subconjuntos de células T (datos no mostrados). Las células se eliminan contaminantes como vertedero de FITC durante FACS clasificación de procedimiento en el siguiente paso (Figura 2b). FACS manchas de marcador CD4 no es necesario y esta población celular puede ser visto a través de FSC en una parcela cuando se combina con anti-CD25 humano, sin embargo, se podía hacer. Tregs se ordenan como 1% de las células que expresan el mayor número de CD25 en todos los grupos de sujetos. La aplicación de este procedimiento riguroso para todos los sujetos independientemente de la condición de la enfermedad nos ha permitido utilizar sólo una relación entre células T reguladoras y células T de respuesta (1:10) en todos los grupos sometidos a prueba. Además, las mismas condiciones de trabajo tan bien que una diferencia de potencial represivas Treg se observó entre ingenuo e in vivo de células T activadas utilizado como respuesta, que, en base a las diferencias entre ellos, se podría esperar una. También hemos determinado que las células después de FACS clasificación tiene que ser centrifugadas antes de ser creado en el ensayo de supresión.
Proliferación se midió con timidina tritiada. Por otra parte, la proliferación celular se puede medir con 5-bromo-2'-desoxiuridina, un análogo de la pirimidina, que se incorpora al ADN de nueva síntesis en lugar de timidina. La detección de BrdU se basa en la disociación de europio, de un ion ligado a anticuerpos que reconocen BrdU (anti-BrdU-UE) que en el procedimiento de detección de la señal de fluorescencia se disocia liberando de que se puede medir en un fluorómetro 8. Según el fabricante (DELFIA) este ensayo es de una sensibilidad comparable a la de [3H] timidina. Seguimiento de la proliferación celular también se puede hacer utilizando, por ejemplo, los derivados de la sal de tetrazolio MTT o ensayos en XTT disponible de la ATCC, donde la relación entre el número de células y la señal producida tiene que ser establecido por primera vez, lo que permite la cuantificación espectrofotométrica de los cambios en la tasa de la célula proliferación y viabilidad. Otra alternativa es el uso de la viabilidad celular DHL y ensayo de proliferación, en base a la cuantificación del número de células fluorimétrica de vida y viabilidad. Opción potencial es para teñir las células T de respuesta sólo con CFSE (carboxifluoresceína succinimidil éster) y controlar la reducción de la mancha con cada división siguiente, durante el tiempo de cultivo. Sin embargo, en función de estimulación utilizado en el ensayo, ya la incubación de más de 48 horas puede causar picos indistinguibles de las células CFSE-positivo. Por lo tanto, cada uno de los ensayos tiene algunas ventajas y desventajas, y tiene que ser optimizado para lograr los resultados deseados.
CPM para las pruebas de anti-CD3 humano revestido siempre se realizan ensaludable PBMC y deben estar por encima de 5000, pero no por encima de 15.000 a fin de cuentas que se utilizarán en este tipo de ensayo. Por lo general, configurar cuentas de diferentes / proporción de células cuando se prueba cada lote de cuentas que hacemos, y en la mayoría de los casos tenemos la más consistente cpm con 3 bolas / celular con 25.000 células / pocillo. Por lo general, repiten recubrimiento si CPM durante las pruebas de lotes están por debajo de 3.000, hasta llegar a 5,000-15,000 cpm / pocillo. Por lo tanto, el proceso de recubrimiento se ha comprobado en varios niveles y consideramos que es confiable. Por lo tanto, cuando los CPM de cierto grupo de sujetos (como auto-anticuerpos positivos sujetos en riesgo de desarrollar DT1) son consistentemente más bajos en comparación con sujetos sanos, tenemos una razón para concluir que el proceso de transducción de señal podría verse afectada. , Aunque muchos estudios han utilizado células ingenuo como respuesta en los ensayos publicados hasta la fecha de supresión 09.12, algunos, por ejemplo, han utilizado ya sea como respuesta CD4 en condiciones de ensayo muy diferentes de 13 o PBMC como respuesta, en la presencia de PBMC como APC y los puso en una sola cultura y co-añadió con Tregs 14 o 15 como supresores de los monocitos. A pesar de que CPM se genera en todas las variantes de ensayo y conclusiones acerca de la proliferación se hizo, creemos que el tener más puro subconjunto de células uniformes como respuesta da resultados más específicos y ofrece un potencial para sacar conclusiones adicionales acerca de los Tregs y socorristas. Como nuestro ensayo de supresión que aquí se presenta incluye dos subgrupos separados de células puras como respondedores (CD4 + CD25-y CD4 + CD25low), es posible obtener información valiosa sobre la homeostasis inmune cuando los resultados de sujetos sanos, en comparación con los sujetos afectados o en riesgo de desarrollar una enfermedad causada por la perturbación de la homeostasis inmune (como DT1). Como lo demuestra el número creciente de estudios, in vivo de células T activadas (CD4 + CD25low) muestran deterioro de la sensibilidad a los efectos supresores de células T reguladoras 16-19. La explicación exacta para que el comportamiento requiere más investigación. Además de esto, nosotros y otros han demostrado que células T reguladoras en pacientes con DT1 tiene un defecto funcional 2,9,10, que también es válido para auto-anticuerpo-positivos, en riesgo de desarrollar DT1, como hemos demostrado en Figura 6 en nuestro reciente informe 1. Una de las posibilidades es que todas las células T CD4 en los sujetos afectados y en riesgo de desarrollar DT1 tienen un defecto común en la transducción de señales que les ha impedido responder a la estimulación adecuada y que afectan a su función efectora. Como resultado de la transducción de señales en peligro, las células T de respuesta que generaría menor cpm (como se muestra en la Figura 3c) y Tregs no suprimir de manera eficiente. Las posibilidades de esta u otras quedan por explorarse más a fondo. Debido a la gran papel juegan Tregs en la salud y la enfermedad, muchos laboratorios han medido la función Treg ajuste de la prueba a sus necesidades y habilidades. Por lo tanto, hay muchos factores en el ensayo puede variar (de respuesta / Treg aislamiento, tipo y número de los que respondieron, la naturaleza y la fuerza de la estimulación, tipo y número de APC, la relación entre la respuesta / Tregs, el tiempo en la cultura, así como el método de la proliferación de vigilancia ), que afectan a la función de Treg. Este trabajo, por lo tanto, tiene el objetivo de iniciar el proceso de normalización de la prueba que permite la comparación más fácil y directa de los diferentes estudios la evaluación de la función de Treg.
Si se aprueba, este protocolo permitirá la comparación de la función de Treg entre los diferentes laboratorios para los sujetos afectados con enfermedades autoinmunes y otras DT1. Este protocolo tiene una amplia aplicación y se puede utilizar para una evaluación de la función de Treg de cualquier tema, no importa la enfermedad, aunque su valor pronóstico se refiere sólo las enfermedades que son resultado de la perturbación de la homeostasis inmune.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por Max McGee Centro Nacional de Investigación para Menores Diabetesat Colegio Médico de Wisconsin y el Instituto de Investigación de Niños de Wisconsin. Los financiadores no participó en el diseño del estudio, la recopilación de datos y análisis, o la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Biosciences | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Biosciences | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Biosciences | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Biosciences | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Biosciences | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Biosciences | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Home made | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Home made | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Home made | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Home made | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | PerkinElmer, Inc. | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | EMD Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | PerkinElmer, Inc. | 6013621 |
References
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