Summary
调节性T细胞是免疫系统的强有力的抑制器。有一个独特的表面标志物来定义它们的缺乏，因此，调节性T细胞的定义主要功能。在这里，我们描述了一个优化的
Abstract
调节性T细胞（Treg细胞）的自身抗原免疫耐受的关键调解员。此外，他们被感染后的免疫反应的关键调节因子。尽管努力找出独特的调节性T细胞表面标记，唯一的功能是抑制效应T细胞的增殖和功能的能力。虽然很明显，只有在体外试验 ，可用于评估人Treg功能，这将成为问题时，评估的结果，从横断面研究健康细胞和细胞与自身免疫性疾病（如1型糖尿病的T1D）需要的科目中分离进行比较。有一个响应者的T细胞，刺激的性质和强度，Treg细胞的数量和类型的实验室之间的变化很大：应答者比率和使用的数量和类型的抗原提呈细胞（APC）在人类体外抑制实验。这种差异使得比较难以测量Treg细胞功能的研究。 Treg的领域，需要一个标准化的抑制与正常人和自身免疫性疾病的检测工作。我们已经开发出在体外抑制实验表明很少批内变异在健康志愿者相比，与底层的胰腺β细胞的自身免疫性破坏的科目分离的T细胞的刺激。这件作品的主要目的是描述一个在人类体外抑制实验，允许不同的学科组之间的比较。此外，该法有可能划定nTreg功能的一个小的损失，并预计在未来的进一步丧失，从而确定谁可以受益于预防免疫疗法1的科目。下面，我们提供在此过程中所涉及的步骤的详细描述。我们希望用来衡量Treg细胞功能的体外抑制实验的标准化做出贡献。此外，我们提供了这个实验作为一种工具，认识到早期免疫失衡状态和T1D功能的一个潜在的生物标志物。
Protocol
1。设立抑制法检测之前，需要对细胞的刺激和事后大衣tosylactivated珠抗人CD3（克隆UCHT1，终浓度为1μg/ml）检查是否有效地通过设立在体外增殖实验中使用人类的涂层珠T细胞
- 以从原来的小瓶，在磁场的立场地点的M - 450 tosylactivated珠1毫升并按住，直到所有的珠子都坚持管方。删除缓冲区，而管仍然是在磁场的立场。以管的磁立场，并添加了缓存1毫升，放置在磁场的立场管，并删除缓存1，在磁场的立场，而管，重悬珠缓存1毫升，加入抗人CD340μl，激荡在37 ° C 15分钟，加0.1％W / V牛血清白蛋白，并继续为未来的16小时搅拌。
- 在buffer2清洗珠两次5分钟;删除缓冲区buffer21毫升重悬珠，珠是在2-8℃，一旦5分钟buffer3在2-8 ° C使用磁性的立场，如上面所述4 × 8 / ml的终浓度和准备使用。
- 分装50000和25000外周血单核细胞/孔在96孔板一式三份，并添加变量CD3涂层珠（4 × 8珠/毫升，CD3 +1μg/ml，例如1，2，3，4，5珠/细胞），以确定每个细胞珠的最佳数目。文化在72小时后，加1μCi[3H]胸腺嘧啶，继续孵育37 °彗星在未来16个小时。多屏收获板（Millipore公司）收获细胞，加入闪烁液，并读取每分钟计数（CPM）/使用最高级NXT（惠普，CT）。使用珠/ CPMS 5000以上时，细胞的比例，但小于15000的调节性T细胞，这可能会失去抑制功能，以避免过度刺激。通常情况下，3珠/细胞的比例，刺激响应者和Treg细胞在测试到目前为止1-4所有学科组。
2。从全血PBMC的隔离从健康的捐赠者或从人类leukopacks或捉鬼外套（BC），通常采取从健康志愿者和从当地输血中心免费提供（图1）
- 稀BC（〜50毫升），用PBS 1:6（添加250毫升）。现在有300毫升总量。慢慢地稀释公元前层25毫升上15毫升聚蔗糖帕确顶部加至50ml猎鹰管，互不干扰的图层。在800xg离心30分钟在4 ° C与刹车，（在一个水平转头SH - 3000 Sorvall离心机1400rpm）关闭。
- 仔细收集外周血单个核细胞层（中间相），将它转移到一个新的50毫升猎鹰管。洗净PBMC的灌装管与DPBS至50ml。一管收集到2个细胞沉淀。在400xg离心10分钟，4 ° C。重复洗涤步骤两次，每次单管组合成2个细胞沉淀。合并成一个单一的50毫升管细胞沉淀。
- 计数外周血单个核细胞用台盼蓝排斥试验。加入20μL的PBMC台盼蓝180μl染色台盼蓝在1:10稀释。拌匀，取20μL立即hemacytometer计数。位于两个见方的块，每个都含有16个小方格的所有不染，只有蓝染色细胞计数数字。这两个数字的平均值乘以10。这个数字除以100得到的外周血单核细胞/毫升。活菌百分比计算为[1 - （蓝色细胞/细胞总数）× 100]。如果所得的可行性是≥95％。
3。 MACS预排序的CD4 T细胞
- 出发前，转移到一个新的管的PBMC1毫升，添加媒体4毫升准备照射5000rad这些细胞将抗原提呈细胞（APC）。
- 离心10min后PBS/2mM EDTA/0.5％BSA缓冲休息250xg细胞在4 ° C。 PBS/2mM EDTA/0.5％BSA缓冲4毫升倒掉上清，悬浮细胞。
- MACS抗CD4微珠添加200μL和孵育4℃20分钟的彗星。
- 10min后洗净加入250xg PBS/2mM EDTA/0.5％BSA缓冲液和离心机40毫升在4 ° C。脱气，室温PBS/2mM EDTA/0.5％BSA缓冲8毫升倒掉上清液和悬浮。
- 过滤器分离的细胞悬液，采用预分离过滤器，再装上一个LS列。
- 分割的细胞悬液，每超过校准的LS列（deggassed PBS/2mM EDTA/0.5％BSA缓冲3毫升）层4毫升。 LS列在MidiMACS分隔是固定的。细胞悬液之前用完，要么重新运行流穿或添加3毫升deggassed室温PBS/2mM EDTA/0.5％BSA缓冲，让缓冲区贯穿。添加更多的缓冲区，直到它明确的。
- 移液器5毫升到LS列deggassed缓冲区，删除从MidiMACS分隔和地方到一个新的无菌15毫升收集管让〜1.0毫升贯穿LS列。放入列中的柱塞，慢慢推，其余量出来。
- 同时LS列，并结合两个CD4 +分数。添加至50ml PBS和计数细胞。预期收益率高达5X10 8细胞。在400xg离心10分钟，悬浮细胞以及2毫升PBS/2mM EDTA/0.5％BSA缓冲。
4。荧光激活细胞分选（FACS）隔离（图2）
- 制作鸡尾酒抗体CD标记，以下面的细胞表面标志物（保持避光）：20μL抗人CD8 - FITC（克隆RPA - T8），20μL抗人CD14 - FITC（克隆M5E2;脂多糖受体），20μL抗人CD32 - FITC（克隆FLI8.26;FcγRⅡ型）和6μL抗人CD116 - FITC（克隆M5D12; GM -CSFRα链），另外，加入40μl反人类CD4 - APCCy7（克隆RPA - T4）。
- 取5μL2毫升细胞悬液和染色染色的鸡尾酒2μL;这是一个确定的阈值（荧光色素减一，鱼类统营处）5管。
- 加入50μL抗人CD25 - PE（克隆的M - A251; IL -2Rα）污渍的鸡尾酒，并添加鸡尾酒细胞悬液孵育，在4 ° C 30分钟。在PBS缓冲液，离心10分钟，至10 7 / ml的细胞浓度的悬浮细胞的细胞在400xg洗净。
- 准备不染的细胞和细胞或单个荧光染色作为补偿控制细胞咏叹调流式细胞仪（BD公司，圣何塞，新泽西州）的排序中使用的珠。
- 收购在鱼类统营处管的细胞，这将允许用户设置的门槛，为CD25 + T细胞（图2a）的排序。设置FITC阴性细胞周围的门，排除FITC阳性细胞，包括单核细胞，巨噬细胞和所有其他的CD4 +非T细胞（图2b）。
- 在一个单独的情节，借鉴盖茨+ CD25 -，CD25low和CD25high T细胞的调节性T细胞（顶部细胞表达的CD25 +的最高数量的1％）（图2c）。细胞亚群通常表现出高纯度（图2D，2E和2F）。
- 10分钟400xg细胞离心收集管，并保持，直到镀冰。
5。设置细胞培养在96孔板200μl/well（计划表连接）
- CD3涂层珠分装50μL（1微克/毫升）计算，3珠/应答者的细胞，以及完整的媒体悬浮汇集10％人AB血清U型底96孔板。 （例如，使CD3涂层2毫升媒体，采取7.5μl股票CD3涂层珠终浓度为4 × 8 /毫升，稀释媒体2毫升;每50μL将包含75,000 beads-3beads/cell）。
- 照射的APC 5X10 5 / ml细胞浓度稀释，加入50μL到每口井（将包含2.5 × 10 4细胞）与以前增加的刺激，包括标示为“调节性T细胞只”井“，APC的唯一”和“媒体“表1。
- 一式三份以下表1中的设计，添加2.5 × 10 4 / CD4CD25或CD4CD25low T细胞。
- 添加Treg细胞联合培养的比例为1:10（2500 Treg细胞）（B行，表1）和“调节性T细胞只”标记的井，5％的CO 2，CO 2培养箱培养板在37 ° C ，在饱和湿度为72小时。
- 脉冲1μCi[3H]胸腺嘧啶井，并继续在37℃，未来16小时的潜伏期。
6。收获和点票
- 多屏收获板收获细胞，使用惠普filtermate收割机或替代系统。
- 加入闪烁液（Microscint 20），封面用透明塑料盖在最后一步准备收获板。
- 阅读每分钟计数（CPM）/以及使用最高级NXT（惠普，CT）或替代系统。
7。抑制计算的百分比
- 细胞培养在一式三份，平均计算每个条件。如果变异系数> 30％，离群被淘汰，只有两口井CPM的平均值。通过计算得到抑制百分比（SC）/ S] × 100％，其中s = CPM在单一的文化和C = CPM共培养。
- 为幼稚（CD25 -）和效应T细胞在体内激活（CD25low）镀作为响应者T细胞，调节性T细胞的能力，以抑制这些子集的区别是捕获和使用作为一个潜在的功能预后指标的前提基础，活化细胞难以抑制。
8。代表性的成果：
使用方法的变化很大，并在体外培养的人抑制实验所得的结果促使我们进行一个全面的研究条件 ，影响检测1。我们已经制定了一个试验，测试不仅Treg的功能，而且其纯度，考虑调节性T细胞之间的低比例：Teffs（1:10），我们确定前面6。此外，调节性T细胞与在日EIR的能力，成功地抑制天真，在体内激活T细胞，即使在健康受试者，在图3和我们以前的研究2,4，显得更为突出显示免疫平衡被破坏，在危险的科目发展T1D 。该检测工作非常出色，我们比较自然（nTregs），诱导（iTregs）， 并在体外培养扩增nTregs抑制功能的研究，使我们能够健康对照组之间比较它们的功能，最近发生的（RO）的T1D和长期（LS ）T1D科目。我们得出的结论是反渗透T1D科目有更好的能力，产生功能iTregs和扩大nTregs，比LS T1D和健康对照组7。因此，此法可作为承认的免疫失衡的早期和晚期的状态极好的工具。
计划在体外抑制实验所涉及的步骤1的原理演示
图1的照片呈现在体外抑制实验的步骤 。
图2流式细胞仪细胞分离。浇注战略。一个）+ CD25 +阈值调整，根据荧光色素减一（FMO），b）细胞分别为FITC标记的负面门控，彗星）FITC标记的负面细胞被进一步门和CD + CD25 +，CD + CD25low和光盘+ CD25high收集（调节性T细胞）的百分比，D所示），流式细胞仪排序Tregs的排序后，E）流式细胞仪排序排序后的CD + CD25low，和f）流式细胞仪排序后排序的CD4 + CD25 - T细胞
图3。正常人的代表 ）代表每分钟计数的结果，参与所有细胞亚群的单一文化的健康受试者（ 天真，CD25 +，在体内的活性CD25low，抗原提呈细胞- APC（CPM）和调节性T细胞，Treg细胞）以及应答器T细胞共培养（+ CD25 -或CD25low）和调节性T细胞，B）的百分比抑制每个CD25和CD25low响应T的调节性T细胞自体细胞，为健康对照组（ N = 4）。制止被计算为[（SC）/ S] × 100％，其中s = CPM在单一的文化和c = CPM共培养。虽然略有差异调节性T细胞的能力，抑制急救员T细胞被注意到，这是不显着（配对t检验，P = 0.08），C）是CPM的风险科目，每个单一的文化，包括CD25和CD25low作为响应者T细胞，以及APC和调节性T细胞，并联合培养，每个应答者的T细胞亚群调节性T细胞（CD25-/Tregs和CD25low/Tregs）D）每个CD25和CD25low响应者T细胞的抑制百分比接种自体调节性T细胞是风险科目（N = 4）。抑制CD25 -与CD25low响应者T细胞的调节性T细胞的能力差异有显着性（配对t检验，P = 0.04）。
表1。示意图设立在体外抑制实验
| 1-3 | 4-6 | 7-9 | 10-12 | |
| 一 | CD4CD25 - | CD4CD25low | 媒体只 | 媒体只 |
| 乙 | CD4CD25 / - 调节性T细胞 | CD4CD25low /调节性T细胞 | 调节性T细胞只 | APC的唯一 |
| 彗星 | ||||
| ð | ||||
| Ë | ||||
| F | ||||
| 摹 | ||||
| H |
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Discussion
作为唯一的独特功能，调节性T细胞，抑制功能应可靠，统一的测试在同一疾病发展的不同阶段和不同的研究主体之间。我们提供我们这个实验的标准化贡献在我们的实验室开发的抑制实验的细节。在我们广泛的优化研究，我们有决心，刺激T细胞与抗人CD3涂层珠（UCHT1克隆，在1μg/ml浓度组合（相对于市售5μg/ml）作为APC PBMC提供了天然的刺激激活测试科目1都响应者的T细胞和调节性T细胞的能力。抗人CD3抗体的选择是非常重要的，在我们手中只有Ancell抗体了预期的效果，同时刺激与抗人CD3和抗人CD28检测学科组（结果未显示）之间的差异是不够的，而外周血单个核细胞提供共刺激信号的一个完整的调色板，增加的信号转导和高效率的刺激的机会。
该协议可用于leukopacks和病人的血液。唯一的区别是需要的PBMC中分离过程中的聚蔗糖帕确PLUS上加载的血量。在本实验中使用的媒体包含汇集10％人AB血清，这是我们确定为一个伟大的除了检测。然而，在使用之前，血清测试能力，激活的PBMC对自己的（种子sixplicate外周血单个核细胞，并添加一个新的血清和无血清，与旧血清的完全RPMI媒体脉冲的72小时后板，在37℃，收获细胞培养16小时，并获得CPM的读数）。增加PBMC的CPM与新的血清培养是没有好结果，并提出了一个新批号的血清需要。
我们有决心做一个对每一个样品的新的LS列手动排序，MACS给人相当大的更好的收益率的CD4 + T细胞相比，到设备问题。此外，Treg的纯度被确定为> 95％， 在体外增殖（图3a），在健康受试者高抑制潜在的Treg细胞之间的比例为1:10，缺乏CD25的表达（图2d）判断：应答（图3AB）和孤立的T细胞亚群（数据未显示）中最高的Foxp3的表达。 FITC标记的转储在排序过程中的下一步（图2b）的流式细胞仪的污染细胞被淘汰。流式细胞仪的CD4染色标记是没有必要的，这个细胞群中可以看到一个情节与抗人CD25相结合，通过FSC的，但它可以完成。 Tregs的排序为前1％表示在所有学科组中人数最多的CD25 +细胞。这种严格的程序，以独立的疾病状态的所有科目，使我们能够只用一个在测试的所有学科组之间的调节性T细胞和应答的T细胞（1:10）的比例。此外，相同条件下工作这么好，在Treg细胞抑制潜在的差异之间的天真和在体内活化的T细胞反应，使用，根据它们之间的差异，可以预期的1 。我们也决定排序后，流式细胞仪细胞抑制实验前纺。
测定采用氚胸腺嘧啶扩散。另外，细胞的增殖，可使用5 - 溴-2' - 脱氧尿苷，嘧啶模拟，这是纳入到新合成的DNA，而不是胸苷的测量。的BrdU检测的基础上解离铕离子，势必承认BrdU（抗BrdU欧盟），可以在荧光8测量游离释放荧光信号检测程序获取的抗体。据制造商（DELFIA）这个实验是与[3H]胸腺嘧啶的敏感性。跟踪细胞的增殖也可以使用，例如，允许自ATCC细胞数量和产生的信号之间的关系，首先要建立的MTT，XTT法检测四唑盐衍生物，分光光度定量细胞率的变化增殖和活力。然而，另一种方法是使用DHL细胞活力和增殖实验，基于对活细胞的数目和活力荧光定量。其他潜在的选择是染色CFSE（羧基琥珀酰亚胺酯）的应答者的T细胞和监控每分裂的色斑，在培养时间减少。然而，根据在实验中使用的刺激，可引起超过48小时的潜伏期较长CFSE阳性细胞无异峰。因此，每个检测有一定的优势和劣势，进行优化，以达到预期的效果。
检测抗人CD3涂层CPMS总是表现健康外周血单个核细胞，他们应该在5000以上，但不高于15000，以便在使用这种类型的检测珠。我们通常设置了不同的珠/细胞比例每批珠，我们让测试时，在大多数情况下，我们有3珠/ 25000细胞/孔的细胞最一致的CPM。我们通常重复的涂层，如果在批量测试CPMS低于3000，直到我们达到5,000-15,000 CPM /。因此，涂层工艺已在几个层次上检查，我们认为这是非常可靠的。因此，当某些科目组的CPM（如发展T1D风险的自身抗体阳性者）持续降低健康受试者相比，我们已经结束的信号转导过程中可能会受到损害的一个原因。 ，虽然许多研究都作为幼稚细胞应答在这么远9-12出版的抑制实验中，一些例如，使用非常不同的实验条件13或应答者外周血单个核细胞应答，无论是CD4 +的PBMC作为APC的存在，并设置它们在单增加的调节性T 细胞 14 或 15单核细胞作为抑制器共培养。即使CPMS将产生的扩散将在所有检测的变化和结论，我们认为，素净统一的细胞亚群的应答者给出更具体的结果，并持有潜力得出关于调节性T细胞和响应的其他结论。由于我们这里介绍的抑制实验包括两个独立的应答者（CD4 + CD25 -和CD4 + CD25low）纯细胞亚群，它有可能获得有关免疫稳态的有价值的信息时，从正常人的结果进行了比较风险影响或科目发展的一种疾病，导致免疫稳态的扰动（如T1D）。越来越多的研究，在体内活化的T细胞，（CD4 + CD25low）16-19 Tregs的抑制作用的敏感性受损。这种行为的确切解释，需要更多的调查。此外，我们和其他人表明，调节性T细胞在与T1D科目有2,9,10功能的缺陷，这也是真正的自身抗体阳性者，在发展T1D风险，我们已经表明在在我们最近的一份报告1，图6 。可能性之一是，所有的CD4 T学科的影响和风险开发细胞T1D有信号转导的一个共同缺陷，防止他们对刺激作出适当反应，并影响其效应功能。作为妥协的信号转导的结果，应答者的T细胞会产生较低的CPM（图3c所示）和调节性T细胞不能有效地抑制。这或其他的可能性仍然有待进一步探讨。由于调节性T细胞在健康和疾病的发挥的巨大作用，许多实验室测量Treg细胞功能检测，以调整自己的需要和能力。因此，在实验中的许多因素可能会有所不同（应答器/ Treg细胞隔离，类型和数量的工作人员，性质和强度的刺激，类型和装甲运兵车，应答器/调节性T细胞，在培养时间，以及监测扩散的方法之间的比数），影响Treg细胞的功能。因此，这项工作已经开始允许检测评估Treg细胞功能的不同的研究比较容易和直接的标准化过程中的一个目标。
如果获得通过，这项协议将允许Treg细胞功能与T1D和其他自身免疫性疾病影响的科目不同实验室之间的比较。该协议具有广泛的应用，可用于对Treg细胞功能的任何问题，无论疾病的评价，虽然其预后价值属于唯一的疾病，导致免疫稳态的扰动。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究得到了最大麦吉少年Diabetesat医学院的威斯康星州和威斯康星儿童研究所国家工程研究中心。出资者已经没有任何作用，在研究设计，数据收集和分析，或准备的手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Biosciences | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Biosciences | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Biosciences | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Biosciences | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Biosciences | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Biosciences | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Home made | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Home made | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Home made | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Home made | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | PerkinElmer, Inc. | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | EMD Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | PerkinElmer, Inc. | 6013621 |
References
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