Summary
Tregs zijn krachtige onderdrukkers van het immuunsysteem. Er is een gebrek van unieke oppervlakte markers om ze te definiëren, dus, de definities van Tregs zijn vooral functioneel. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde
Abstract
Regulerende T-cellen (Tregs) zijn kritisch bemiddelaars van immuun tolerantie voor zelf-antigenen. Daarnaast zijn ze van cruciaal belang zijn regulatoren van de immuunrespons na een infectie. Ondanks inspanningen om unieke oppervlakte marker op Tregs te identificeren, het enige unieke eigenschap is hun vermogen om de proliferatie en de functie van effector T-cellen te onderdrukken. Hoewel het duidelijk is dat alleen in-vitro-testen kunnen worden gebruikt bij de beoordeling van de menselijke Treg functie, wordt dit probleem bij de beoordeling van de resultaten van cross-sectionele studies waarbij gezonde cellen en cellen geïsoleerd uit patiënten met auto-immuunziekten (zoals type 1 diabetes-T1D) nodig te vergelijken. Er is een grote variabiliteit tussen laboratoria in het aantal en type van de reagerende T-cellen, de aard en de sterkte van de stimulatie, Treg: responder ratio's en het aantal en type van antigeen-presenterende cellen (APC) gebruikt in de menselijke in vitro onderdrukking assays. Deze variabiliteit maakt een vergelijking tussen de studies meten van Treg functie moeilijk. De Treg veld heeft behoefte aan een gestandaardiseerde test onderdrukking die goed werkt met zowel bij gezonde vrijwilligers en mensen met auto-immuunziekten. Hebben we een in vitro assay onderdrukking dat er zeer weinig intra-assay variabiliteit in de stimulatie van T-cellen geïsoleerd uit gezonde vrijwilligers in vergelijking met proefpersonen met een onderliggende auto-immune vernietiging van de pancreas β-cellen shows. Het belangrijkste doel van dit stuk is om een te beschrijven in vitro humane onderdrukking test die vergelijking tussen de verschillende groepen onder voorbehoud maakt. Bovendien, deze test heeft de potentie om een klein verlies in nTreg functie af te bakenen en te anticiperen op verder verlies in de toekomst, waardoor het identificeren van patiënten die baat kunnen hebben bij preventieve immunomodulerende therapie 1. Hieronder geven we een grondige beschrijving van de stappen in deze procedure. We hopen een bijdrage te leveren aan de standaardisatie van de in vitro onderdrukking-test gebruikt om de Treg functie te meten. Daarnaast bieden wij u deze test als een hulpmiddel om een vroege staat van het immuunsysteem onbalans en een mogelijke functionele biomarker voor T1D herkennen.
Protocol
1. Voordat u een onderdrukking-test, moet men de vacht tosylactivated kralen met anti-humaan CD3 (kloon UCHT1, eindconcentratie 1μg/ml) voor de cel stimulatie en daarna controleren of de kralen efficiënt worden bekleed met het opzetten van een in vitro proliferatie assay gebruik van menselijke T-cellen
- Neem 1 ml van de M-450 tosylactivated kralen uit originele flacon, plaats in de magnetische voet en houdt totdat alle kralen hebben gehandeld op grond van de kant van de buis. Verwijder de buffer, terwijl buis is nog steeds in de magnetische stand. Neem de tube uit de magnetische staan en voeg 1 ml buffer1, de buis weer plaats in de magnetische staan en verwijder de buffer1 terwijl de buis in de magnetische stand; resuspendeer kralen in 1 ml van buffer1 en voeg 40μl van anti-humaan CD3, schud bij 37 ° C gedurende 15 minuten, voeg 0,1% w / v BSA en blijven roeren voor de volgende 16 uur.
- Was de kralen in buffer2 twee keer gedurende 5 minuten bij 2-8 ° C en een keer in buffer3 gedurende 5 minuten bij 2-8 ° C met behulp van magnetische staan zoals hierboven uitgelegd, verwijder de buffer en resuspendeer de kralen in 1 ml van buffer2, de kralen zijn 4x10 8 / ml uiteindelijke concentratie en klaar voor gebruik.
- Aliquot 50.000 en 25.000 PBMC / putje in drie exemplaren in een 96-well plaat en voeg wisselend aantal CD3-gecoate kralen (4x10 8 kralen / ml, CD3 1μg/ml, bijvoorbeeld 1, 2, 3, 4, 5 kralen / cel ) om het optimale aantal kralen per cel te bepalen. Na 72 uur in de cultuur, voeg 1μCi [3H] thymidine en blijven incuberen bij 37 ° C voor de komende 16 uur. Oogst cellen in Multiscreen oogst plaat (Millipore), voeg scintillatievloeistof en lees de tellingen per minuut (cpm) / goed met Top Count NXT (Packard, CT). Gebruik maken van de kralen / cel-verhouding bij CPM's boven 5000, maar minder dan 15.000 van overstimulatie van Tregs, die onderdrukkende functie kan verliezen te vermijden. Meestal verhouding van 3 kralen / cel stimuleert zowel de responder en Treg cellen in alle groepen onderwerp tot nu toe 1-4 getest.
2. PBMC geïsoleerd uit vol bloed van gezonde donoren of van menselijke leukopacks of buffy coat (BC), meestal afkomstig van gezonde vrijwilligers en gratis verkrijgbaar bij de plaatselijke Bloedtransfusie Centers (figuur 1)
- Verdun de BC (~ 50 ml) 1:6 met PBS (voeg 250ml). Nu is er 300ml totale volume. Langzaam laag 25ml van de verwaterde BC op de top van 15ml Ficoll-Paque PLUS toegevoegd aan 50 ml Falcon buizen, zonder de lagen. Centrifugeer op 800xg (1400 toeren in een Sorvall centrifuge met swingende emmer rotor SH-3000) gedurende 30 minuten bij 4 ° C, met remmen uitgeschakeld.
- Zorgvuldig verzamelen PBMC laag (intermediaire fase) en overbrengen naar een nieuw 50 ml Falcon buizen. Was PBMC door het vullen van de buizen tot 50 ml met DPBS. Verzamel twee celpellets in een buis. Centrifugeer bij 400xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Herhaal wasstap twee keer, telkens een combinatie 2 celpellets in een enkele buis. Combineer alle celpellets in een 50 ml buis.
- Tellen met behulp van PBMC trypan Blue uitsluiting te testen. Maak een 1:10 verdunning in trypan Blue door het toevoegen van 20μl van PBMC aan 180μl van trypan Blue vlek. Meng goed en neem 20μl onmiddellijk tellen in hemacytometer. Tel-nummers van alle ongekleurde en alleen blauw gekleurde cellen zich in twee vierkante blokken met elk 16 kleinere pleinen. Neem het gemiddelde van beide getallen en vermenigvuldig met 10. Deel dit getal door 100 om het aantal PBMC / ml te krijgen. Percentage van de levensvatbare cellen te berekenen als [1 - (aantal blauwe cellen / totaal aantal cellen) x100]. Verder als levensvatbaarheid is ≥ 95%.
3. MACS pre-soort van CD4 T-cellen
- Alvorens verder te gaan, overdracht 1 ml van PBMC in een nieuwe buis, voeg 4 ml van de media aan cellen voor te bereiden op bestraling met 5000rad-deze zullen worden antigen-presenterende cellen (APC).
- Centrifugeer de rest van de cellen op 250xg in PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffer voor 10 min. bij 4 ° C. Giet supernatant en resuspendeer cellen in 4 ml van PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffer.
- Voeg 200μl van MACS anti-CD4 microbolletjes en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
- Was door het toevoegen van 40ml van PBS/2mM EDTA/0.5% BSA-buffer en centrifugeer bij 250xg voor 10min bij 4 ° C. Giet supernatant en resuspendeer in 8 ml ontgast, kamertemperatuur PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffer.
- Filter-scheiden de celsuspensie met behulp van pre-scheiding filters voordat u ze op een LS kolom.
- Splits de celsuspensie en laag 4ml elk meer dan gekalibreerde LS kolom (met 3 ml van deggassed PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffer). LS column is vastgesteld in de MidiMACS separator. Voordat celsuspensie opraakt, zowel re-run doorstroomsysteem of voeg 3 ml van deggassed kamertemperatuur PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffer en laat de buffer doorlopen. Voeg meer buffer totdat het komt duidelijk.
- Pipetteer 5 ml deggassed buffer op de LS kolom, verwijder LS Column uit de MidiMACS afscheider en plaatsen in een nieuwe steriele 15 ml buis collectie te laten ~ 1,0 ml doorlopen. Zet de zuiger in de kolom en langzaam druk op de rest van devolume uit.
- Doe hetzelfde met zowel LS kolommen en combineren de twee CD4 + fracties. Voeg tot 50 ml PBS en te tellen cellen. Verwachte opbrengst is aan 5x10 8 cellen. Centrifugeer bij 400xg gedurende 10 minuten en resuspendeer cellen goed in 2 ml PBS/2mM EDTA/0.5% BSA buffer.
4. Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) isolatie (figuur 2)
- Maak een cocktail van antilichamen tegen CD markers om de volgende celoppervlaktemerkers (blijven beschermd tegen licht): 20 ui van anti-humaan CD8-FITC (kloon RPA-T8), 20 ui van anti-humaan CD14-FITC (kloon M5E2; LPS receptor), 20 ui van anti-humaan CD32-FITC (kloon FLI8.26, FcγR-type II) en 6 pl van anti-humane CD116-FITC (kloon M5D12, GM-CSFRα keten) en, subsidiair, voeg 40μl anti -menselijke CD4-APCCy7 (kloon RPA-T4).
- Neem 5μl uit de 2 ml celsuspensie en vlek met 2μl van de vlek cocktail, dit is een buis voor het bepalen van de drempel (fluorochroom Minus One-FMO) 5.
- Voeg 50 ui van anti-humaan CD25-PE (kloon M-A251, IL-2Rα) om de vlek cocktail, en voeg de cocktail aan celsuspensie en incuberen bij 4 ° C 30 minuten. Was cellen in PBS buffer, centrifugeer dan bij 400xg gedurende 10 minuten en resuspendeer cellen tot een cel concentratie van 10 7 / ml.
- Bereid ongekleurd cellen en cellen of kralen gekleurd met enkele fluorochroom als compensatieregeling, gebruiken voor cell sorteren op FACS Aria (BD Biosciences, San Jose, NJ).
- Verwerven van cellen in de FMO buis waarmee de gebruiker de drempel voor het sorteren van CD25 + T-cellen (Figuur 2a). Stel een hek rondom FITC-negatieve cellen om FITC-positieve cellen, bestaande uit monocyten, macrofagen en alle andere CD4 +-non-T-cellen (Figuur 2b) uit te sluiten.
- In een aparte plot, trekken poorten voor CD25-, CD25low en CD25high T-cellen-Tregs (top 1% van de cellen die het hoogste aantal CD25) (figuur 2c). Cel subsets Typisch voor een hoge zuiverheidsgraad (figuur 2d, 2e en 2f).
- Centrifuge verzameling buizen met cellen op 400xg gedurende 10 minuten en bewaar ze op ijs tot plating.
5. Stel celcultuur in 96-well plaat (schema bijgevoegd als Tabel 1) in 200μl/well
- Aliquot 50μl van CD3-gecoate kralen (1 ug / ml) berekend op 3 kralen / responder cel in een goed, geresuspendeerd in volledige media met 10% gepoolde humane AB-serum in U-bodem 96-wells platen. (Bijvoorbeeld, om 2 ml media te maken met CD3-coating, 7.5μl te nemen van de balans opgemaakt van CD3-gecoate kralen-eindconcentratie 4x10 8 / ml en verdun in 2 ml van de media; elke 50μl zal 75.000 beads-3beads/cell bevatten).
- Verdunnen bestraald APC tot 5x10 5 / ml celconcentratie en voeg 50μl (bevat 2,5 x 10 4 cellen) in elk putje met een eerder toegevoegd stimulatie, met inbegrip van bronnen bestempeld als "Tregs only", "APC only" en "media alleen maar" in tabel 1.
- Voeg 2,5 x 10 4 / goed CD4CD25-of CD4CD25low T-cellen in triplo volgende ontwerp in tabel 1.
- Voeg Tregs aan co-culturen (rij B, tabel 1) in de verhouding 01:10 (2500 Treg cellen) en te putten bestempeld als "Tregs only" en incubeer de plaat bij 37 ° C in CO 2 incubator met 5% CO 2 , in verzadigde luchtvochtigheid voor 72 uur.
- Pulse putten met 1μCi [3H] thymidine en blijven incubatie bij 37 ° C voor de volgende 16 uur.
6. Oogsten en tellen
- Oogst cellen op multiscreen oogst plaat met behulp van Packard filtermate harvester of alternatief systeem.
- Voeg scintillatievloeistof (Microsint 20), te dekken oogsten plaat met doorzichtige kunststof afdekking ter voorbereiding van de laatste stap.
- Lees tellingen per minuut (cpm) / goed met Top Count NXT (Packard, CT) of alternatief systeem.
7. Computing percentage van de onderdrukking
- Als cellen werden gekweekt in triplo, is het gemiddelde berekend voor elke conditie. Als de variatiecoëfficiënt is> 30%, is de uitschieter geëlimineerd en slechts cpm uit twee putten zijn gemiddeld. Percentage van de onderdrukking wordt verkregen door het berekenen van [(sc) / s] x 100%, waarbij s = cpm in enkele cultuur-en c = cpm in co-cultuur.
- Als naïef (CD25-) en in vivo geactiveerd (CD25low) effector T-cellen worden uitgeplaat als responder T-cellen, wordt het verschil in het vermogen van Tregs aan elk van deze deelverzamelingen te onderdrukken gevangen en gebruikt als een potentiële functionele prognostische indicator gebaseerd op de vooronderstelling dat de geactiveerde cellen moeilijker te onderdrukken.
8. Representatieve resultaten:
Grote variabiliteit in de gebruikte methoden en de resultaten zijn afgeleid van in vitro humane onderdrukking-test voor ons aanleiding om een uitgebreide studie van omstandigheden beïnvloeden van de test een uit te voeren. We hebben een test die niet alleen Treg functie tests, maar ook hun zuiverheid, gezien de lage verhouding tussen Tregs: Teffs (1:10), die we eerder vastgesteld 6. Daarnaast, Tregs verschillen in thMER vermogen om met succes te onderdrukken naïef en in vivo-geactiveerde T-cellen, zelfs bij gezonde personen, zoals weergegeven in figuur 3 en in onze vorige studies 2,4, die overgaat in meer op de voorgrond als immuun balans is aangetast, zoals bij patiënten in gevaar te ontwikkelen T1D . De test werkte heel goed in de studie, waar we ten opzichte van onderdrukkende functie van de natuurlijke (nTregs), induceerbare (iTregs) en in vitro uitgebreid nTregs, waardoor we hun functie vergelijken tussen gezonde controlepersonen, recent-onset (RO) T1D en langdurige (LS ) T1D onderwerpen. We concludeerden dat RO T1D onderwerpen betere capaciteit van het genereren van functionele zowel iTregs en uitgebreid nTregs in vergelijking met LS T1D en gezonde controlepersonen 7 had. Zo kan deze test gebruikt worden als een uitstekend hulpmiddel in de erkenning van zowel een vroege en late toestand van het immuunsysteem onbalans.
Schema 1 Schematische voorstelling van de stappen die betrokken zijn bij in-vitro-onderdrukking-test
Figuur 1. Stappen van de in vitro assay onderdrukking gepresenteerd met foto's
Figuur 2. Poortsignalen strategie in FACS celisolatie. a) de CD25 + drempel was aangepast aan fluorochroom Minus One (FMO), b) cellen werden gated als FITC-negatief, c) FITC-negatieve cellen werden verder gated en verzameld als CD + CD25-, CD + CD25low en CD + CD25high ( Tregs) afgebeeld met percentages, d), FACS gesorteerd Tregs na sortering,) e FACS gesorteerd CD + CD25low na sortering, en f), FACS gesorteerd CD4 + CD25-T-cellen na sortering
Figuur 3. Representatieve resultaten van gezonde proefpersonen een) vertegenwoordiger resultaten van tellingen per minuut (cpm) van gezonde proefpersonen gepresenteerd als losse culturen voor alle cel subsets betrokkenen (naïef-CD25-, in vivo geactiveerde-CD25low, antigeen-presenterende cellen, APC en regulatoire T-cellen-Treg) als co-culturen van responder T-cellen (CD25-of CD25low) en Tregs. b) Percentage van de onderdrukking van elke CD25-en CD25low responder T-cellen door autologe Tregs wordt gepresenteerd voor gezonde proefpersonen (n = 4). Onderdrukking is berekend als [(sc) / s] x 100%, waarbij s = cpm in enkele cultuur-en c = cpm in co-cultuur. Hoewel klein verschil in capaciteit van Tregs aan responder T-cellen te onderdrukken werd opgemerkt, was het niet significant (gepaarde t-test p = 0,08). C) Gepresenteerd worden cpm van het risico onderwerpen voor elke afzonderlijke cultuur, waaronder CD25-en CD25low als responder T-cellen als APC en Tregs, en co-culturen waar elke responder T-cel subset is met Tregs (CD25-/Tregs en CD25low/Tregs). d) Percentage van de onderdrukking van elke CD25-en CD25low responder T-cellen gezaaid door autologe Tregs wordt gepresenteerd voor het risico proefpersonen (n = 4). Het verschil in capaciteit van Tregs aan CD25-versus CD25low responder T-cellen te onderdrukken was significant (gepaarde t-test p = 0,04).
Tabel 1. Schematische opzet van in vitro onderdrukking-test
| 1-3 | 4-6 | 7-9 | 10-12 | |
| Een | CD4CD25- | CD4CD25low | media alleen | media alleen |
| B | CD4CD25-/ Tregs | CD4CD25low / Tregs | Tregs alleen | APC alleen |
| C | ||||
| D | ||||
| E | ||||
| F | ||||
| G | ||||
| H |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als enige unieke eigenschap om Tregs, moet onderdrukkende betrouwbaar functioneren en op uniforme wijze worden getest tussen de onderwerpen op verschillende fasen van de ziekte ontwikkeling binnen het zelfde en tussen de verschillende studies. Wij bieden u de details van de onderdrukking test ontwikkeld in ons laboratorium als onze bijdrage aan de standaardisatie van deze test. In onze uitgebreide optimalisatie studie hebben we vastgesteld dat T-cel stimulatie met anti-humaan CD3-gecoate kralen (UCHT1 kloon, de concentratie van 1μg/ml (in tegenstelling tot commercieel beschikbare 5μg/ml) in combinatie met PBMC als APC natuurlijke stimulatie kan activeren en zowel de responder T-cellen en Tregs in de onderzochte proefpersonen 1. De keuze van anti-humaan CD3 antilichaam is van groot belang, net als in onze handen alleen Ancell antilichaam gaf de verwachte resultaten. Gelijktijdige stimulatie met anti-humaan CD3 en anti- menselijke CD28 was niet voldoende om de verschillen tussen groepen onderwerp (resultaten niet getoond) te detecteren, terwijl de PBMC bood een compleet palet van co-stimulerende signalen, waardoor de kans op signaaltransductie en efficiënte stimulatie.
Dit protocol kan gebruikt worden met zowel leukopacks en de patiënt bloed. Het enige verschil is de hoeveelheid bloed die moet worden geladen op de top van de Ficoll-Paque PLUS in PBMC geïsoleerd procedure. Media gebruikt in deze test bevat 10% gepoolde humane AB serum, dat we vastbesloten om een geweldige aanvulling op de test worden. Echter, voordat wordt gebruikt, het serum te worden getest op het vermogen om te PBMC activeren op zijn eigen (zaad PBMC in sixplicate en voeg compleet RPMI media met de oude serum, zonder serum en met een nieuwe serum. Na 72 uur puls de Plaat uit, incubeer 16 extra uren bij 37 ° C, oogst cellen en het verkrijgen van lezingen cpm). Verhoogde cpm van PBMC gekweekt met nieuw serum is niet goed resultaat en stelt een behoefte aan een serum met nieuwe lotnummer.
We hebben vastgesteld dat MACS sortering handmatig gedaan met een nieuwe LS kolom voor elk monster aanzienlijk beter rendement van de CD4 + T-cellen geeft in vergelijking met Automax. Daarnaast werd Treg zuiverheid vastbesloten tot> 95% zijn, zoals beoordeeld door CD25 expressie (figuur 2d), het ontbreken van in vitro proliferatie (figuur 3a), hoge onderdrukkende potentieel bij gezonde proefpersonen in een verhouding 01:10 tussen de Treg: responders ( figuur 3AB) en het hoogst Foxp3 uitdrukking onder geïsoleerde T-cel subsets (gegevens niet getoond). De contaminerende cellen worden geëlimineerd als FITC dump tijdens de FACS-sortering procedure in de volgende stap (Figuur 2b). FACS kleuring van CD4-marker is niet nodig en deze cel bevolking kan worden gezien door FSC op een perceel in combinatie met anti-humaan CD25, maar het zou kunnen worden gedaan. Tregs worden gesorteerd als top 1% van de cellen die het hoogste aantal CD25 in alle groepen onderwerp. Het toepassen van deze rigoureuze procedure om alle vakken, onafhankelijk van de status van de ziekte konden we slechts een verhouding tussen Tregs en responder T-cellen (01:10) in alle geteste onderwerp groepen te gebruiken. Daarnaast, op dezelfde voorwaarden werken zo goed dat een verschil in Treg onderdrukkende potentiële werd gezien tussen naïef en in vivo geactiveerde T-cellen die worden gebruikt als responders, die gebaseerd is op de verschillen tussen hen, kan worden verwacht 1. We hebben ook vastgesteld dat na het FACS-sortering-cellen moeten worden afgedraaid alvorens te worden opgericht in onderdrukking test.
Proliferatie werd gemeten met behulp van getritieerd thymidine. Als alternatief kan celproliferatie worden gemeten met behulp van 5-broom-2'-deoxyuridine, een pyrimidine analoog, dat is opgenomen in nieuw gesynthetiseerde DNA in plaats van thymidine. Detectie van BrdU is gebaseerd op de dissociatie van europium, een ion gebonden aan antilichamen die BrdU (anti-BrdU-EU) die in de procedure van de signaal detectie wordt losgekoppeld het vrijgeven van fluorescentie kan worden gemeten in een fluorometer 8. Volgens de fabrikant (DELFIA) deze test is vergelijkbaar met de gevoeligheid voor [3 H] thymidine. Tracking celproliferatie kunnen ook worden gedaan met behulp van, bijvoorbeeld, derivaten van tetrazoliumzout in MTT of XTT testen die beschikbaar zijn vanaf ATCC, waar de relatie tussen het aantal cellen en signaal geproduceerd moet eerst worden vastgesteld, waardoor spectrofotometrisch kwantificering van veranderingen in de snelheid van de cel proliferatie en levensvatbaarheid. Nog een ander alternatief is het gebruik van DHL levensvatbaarheid van de cellen en proliferatie assay, op basis van fluorimetrische kwantificering van levende cel nummers en levensvatbaarheid. Andere mogelijke keuze is om responder T-cellen vlek alleen met CFSE (carboxyfluoresceïne succinimidylester) en het verminderen van de vlek met iedere volgende indeling tijdens het kweken tijd te volgen. Echter, afhankelijk van de stimulatie worden gebruikt in de test, kan langere incubatietijd van meer dan 48 uur oorzaak niet te onderscheiden pieken van CFSE-positieve cellen. Zo heeft elk van de testen heeft een aantal voor-en nadelen en moet worden geoptimaliseerd om de gewenste resultaten te bereiken.
CPM's voor het testen van anti-humaan CD3-coating worden altijd uitgevoerd opgezond PBMC en ze moeten boven de 5000, maar niet boven de 15.000 om voor kralen te worden gebruikt in dit type van een test. We meestal zetten verschillende kralen / cel ratio bij het testen van elke partij van de kralen die we maken, en in de meeste gevallen hebben we de meest consistente cpm met 3 kralen / cel met 25.000 cellen / putje. We meestal herhalen coating als CPM's tijdens de batch-testen worden hieronder 3000, totdat we bij 5,000-15,000 cpm / goed. Zo is de coating proces gecontroleerd op verschillende niveaus en we beschouwen het als betrouwbaar. Daarom, wanneer CPM's van bepaalde groep van personen (zoals auto-antilichaam-positieve patiënten in gevaar te ontwikkelen T1D) consistent zijn lager in vergelijking met gezonde proefpersonen, hebben we een reden om te concluderen dat signaaltransductie proces kan worden aangetast. , Hoewel veel studies hebben gebruikt naïeve cellen als responders in onderdrukking testen tot nu toe 9-12 gepubliceerd, wat, bijvoorbeeld, hebben gebruikt of CD4 als responders in zeer verschillende testomstandigheden 13 of PBMC als responders, in de aanwezigheid van PBMC als APC en zet ze op in single-en co-cultuur met toegevoegde Tregs 14 of 15 monocyten als onderdrukkers. Hoewel CPM's worden gegenereerd in alle assay variaties en conclusies over de proliferatie zal worden gemaakt, we denken dat het hebben van zuiverder uniform cel subset als responders meer specifieke resultaten geeft en heeft potentie om meer conclusies te trekken over zowel Tregs en responders. Als onze onderdrukking test hier gepresenteerde omvat twee afzonderlijke zuivere cel subsets als responders (CD4 + CD25-en CD4 + CD25low), is het mogelijk om waardevolle informatie over het immuun homeostase te krijgen wanneer de resultaten van gezonde proefpersonen worden vergeleken met aangetast of onderwerpen op risico's voor de het ontwikkelen van een ziekte als gevolg van verstoring van het immuunsysteem homeostase (zoals T1D). Zoals blijkt uit groeiend aantal studies, in vivo geactiveerde T-cellen (CD4 + CD25low) tonen een verminderde gevoeligheid voor de onderdrukkende werking van Tregs 16-19. De exacte verklaring voor dat gedrag vereist meer onderzoek. In aanvulling hierop, hebben wij en anderen laten zien dat Tregs bij patiënten met een T1D hebben een functionele defect 2,9,10, wat ook geldt voor auto-antilichaam-positieve personen, in gevaar te ontwikkelen T1D, zoals we hebben aangegeven in Figuur 6 in onze recente verslag 1. Een van de mogelijkheden is dat alle CD4-cellen T in vakken getroffen en in gevaar te ontwikkelen T1D hebben een gemeenschappelijke defect in signaaltransductie voorkomen dat ze adequaat reageren op stimulatie en die hun effector functie. Als gevolg van gecompromitteerde signaaltransductie, zou responder T-cellen worden door een lagere cpm (zie figuur 3c) en Tregs zou niet efficiënt te onderdrukken. Deze of andere mogelijkheden moeten nog worden onderzocht. Vanwege de grote rol Tregs spelen in de gezondheid en ziekte, hebben veel laboratoria gemeten Treg functie het aanpassen van de test aan hun behoeften en mogelijkheden. Zo kunnen vele factoren in de test variëren (responder / Treg isolatie, type en het aantal responders, de aard en de sterkte van de stimulatie, het type en aantal van de APC, verhouding tussen responder / Tregs, tijd in de cultuur, maar ook als methode van monitoring proliferatie ), waardoor de Treg functie. Dit werk heeft dus een doel om het proces van standaardisatie van de test waarmee gemakkelijker en directe vergelijking van verschillende studies het beoordelen van de Treg functie te starten.
Wordt aangenomen, zullen dit protocol maken voor de vergelijking van Treg functie tussen verschillende laboratoria voor personen besmet zijn met T1D en andere auto-immuunziekten. Dit protocol is een brede toepassing en kan worden gebruikt voor een evaluatie van de Treg functie van elk onderwerp, ongeacht van de ziekte, hoewel de prognostische waarde heeft enkel betrekking op ziekten die gevolg is van verstoring van het immuunsysteem homeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door Max McGee National Research Center for Juvenile Diabetesat Medical College of Wisconsin en Children's Research Institute of Wisconsin. De financiers hadden geen rol in de opzet van de studie, gegevensverzameling en-analyse, of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Biosciences | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Biosciences | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Biosciences | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Biosciences | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Biosciences | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Biosciences | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Home made | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Home made | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Home made | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Home made | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | PerkinElmer, Inc. | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | EMD Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | PerkinElmer, Inc. | 6013621 |
References
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. B. ioresponsive Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
