Summary
Роговица уникален тем, что ему не хватает сосудистых тканей. Тем не менее, высокие темпы роста кровеносных сосудов и выживания могут быть вызваны в роговицы мощным ангиогенных факторов. Таким образом, роговица может предоставить нам ценный инструмент для исследования кровеносных сосудов. Этот протокол свидетельствует о том, как выполнить мышиной модели роговицы анализа карман и, как оценить ангиогенез индуцированных ангиогенных факторов с использованием этой модели.
Abstract
Нормальные роговицы ясно сосудистых тканей. Тем не менее, кровеносных сосудов могут быть вызваны для роста и выживания в роговице, когда мощный ангиогенных факторов находятся в ведении 1. Эта уникальность сделал анализ роговицы кармана один из наиболее часто используемых моделей для ангиогенеза исследований. Роговицы составляет несколько слоев клеток. Таким образом, можно встроить гранул содержащих ангиогенного фактора интереса к роговице, чтобы исследовать ее ангиогенного эффекта 2,3. Здесь мы предоставляем шаг за шагом демонстрация того, как (I) производят ангиогенного фактора содержащих гранулы (II) вставлять гранул в роговицу (III) анализирует ангиогенеза индуцированного ангиогенеза фактор интереса. Так как основной фактор роста фибробластов (bFGF) известен как один из самых мощных факторов ангиогенеза 4, он используется здесь, чтобы побудить ангиогенеза в роговице.
Protocol
Все оборудование и реагенты, используемые стерильны. Протокол был одобрен уходу за животными и использование комитета (ACUC) в НОУ / NIH (исследования на животных, протокол НОУ-553), и была выполнена в соответствии с НИЗ руководящие принципы и правила.
1. Производство ангиогенного фактора содержащих гранулы
В этой части, содержащие гранулы ангиогенного фактора интереса готовы.
- Сделать 10% (м / о) сукральфат решение с PBS. Магазин при комнатной температуре.
- Сделать 12% (м / о) поли-НЕМА абсолютным этанолом. Магазин при комнатной температуре.
- Сделать 1 мкг / мкл раствора bFGF. Хранить в -80 ° C.
- Для того, чтобы 50 гранул, смешайте 5 мкл поли-НЕМА, 1 мкл сукралфата и 4 мкл исходного раствора bFGF, вихревые тщательно.
- Место кусок чистой парафильмом в чашке Петри, подвергать его под ультрафиолетовым светом в течение 15 мин в капюшоне культуры ткани. Оставьте 0,2 мкл раствора смесь на парафильмом для одной таблетке. Таким образом, 10 мкл раствора смеси должно дать 50 гранул. Пусть гранулы высушивают при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Сушеные гранулы могут храниться в 4 ° С в течение нескольких дней, или -80 ° С в течение нескольких месяцев.
- После использования, подглядывать и забрать гранулы кончиками пару щипцов. Будьте предельно осторожны, чтобы не сломать их или сделать их весной прочь.
2. Выполнение карман роговицы мыши анализа
В этой части мы покажем, как сделать карман в роговицы мыши, и, как вставить шарик в карман. Ангиогенных факторов, содержащихся в гранулах будет постепенно поступать в прилегающих районах роговицы (рис. 1). В этой демонстрации, мы используем 8-недельного женщин C57/Bl6 мышей.
- Мышь глубоко систематически анестезии смесью кетамина (75 мг / кг) и ксилазина (5mg/kg, IP-инъекции). Это будет держать мышь под наркозом состоянии в течение 30-60 мин. Актуальные анестезии (0,5% proparacaine HCl) применяется к роговице. Через 5 мин, исправить один глаз при вскрытии микроскопом.
- Очень нежный надрез в середине роговицы 1,2 -1,4 мм от лимба роговицы (как показано на рисунке 1) с ножом фон Грефе катаракты. Будьте предельно осторожны, чтобы не прорезать роговицы.
- Карманные производится по эпителия слой роговицы горизонтально вставки нож в середину роговицы и расширение нож в сторону лимба тщательно (рис.1). Размер кармана должна быть достаточно большой, чтобы разместить один фактор ангиогенеза содержащих гранулы. Будьте предельно осторожны, чтобы не прокол через роговицу.
- Вставьте шарик с парой щипцов в карман медленно. Попробуйте сделать гранул плоской, как это возможно.
- После имплантации гранул, мази антибиотик офтальмологических применяется для глаз. Инструменты протирают 70% спиртом прокладки между животными.
- Подведите указатель мыши к теплой и сухой области и следить за ним, пока он не в состоянии поддерживать вертикальное положение, а затем вернуть его домой клетку. Системные анальгетики (например, бупренорфин, 2 мг / кг, внутрибрюшинно инъекций) и актуальные мазь с антибиотиком (например, гентамицин) приведены два раза в день в течение 2 дней после операции и мышь находится под пристальным контролем в течение 3 дней. Исцеление, как ожидается, завершится в течение первых 48 часов после операции. Глаз с кармана будут рассмотрены под щелевой лампой biomicro рамки между дней 4-10 после имплантации гранул.
3. Представитель результаты
- Через семь дней после имплантации гранул, мышь под наркозом системно и местно, как описано в пункте 2.1.
- Соблюдайте кровеносных сосудов в роговице индуцированного ангиогенеза фактором при вскрытии микроскопом. В роговице обрабатывают автомобиль, никакого роста кровеносных сосудов может наблюдаться (рис. 2, транспортное средство обработанных роговицы). В роговице получавших bFGF, надежный ангиогенез можно видеть (рис. 2В). Рост кровеносных сосудов можно оценить, используя максимальная длина кровеносных сосудов (от нормального лимбальных судов к началу новых сосудов), а общий кровеносный сосуд областях (рис. 2, б, очерчены с красной пунктирной линии на bFGF обработанных роговицы). Другие методы количественного также были описаны 2,5.
Рисунок 1. . Нормальная роговица с H & E окрашивания. Нет кровеносных сосудов существует в нормальной роговицы. B. Сделать кармана под слоем эпителия роговицы. C. Добавить шарик в карман. D. Ангиогенного фактора освобождается от гранул, а также новые кровеносные сосуды растут из нормального лимбальных судов.
Рисунок 2. Представителю результат через пять дней после им-плантации гранул.. Роговица с гранул содержащих только носитель. Нет новых кровеносных сосудов в роговице. Только уже существующие лимбальных нормального суда, не видны. B. Роговица с bFGF гранул содержащих. Прочная новых кровеносных сосудов (штрих-строку) вырос с уже существующими нормальными лимбальных судов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Карманные роговицы мыши анализа модель была впервые описана в 1979 году Muthukkaruppan VR и Ауэрбах R 6. Подробные протоколы были опубликованы различными лабораториями 2,3,7,8. Наша лаборатория изменен и использовал этот метод в наших исследованиях в течение многих лет 4. Карманные роговицы мыши анализа является относительно простой модели с большой воспроизводимостью. Еще одним преимуществом этой модели является то, что, поскольку роговица обычно отсутствуют кровеносные сосуды, есть минимальное количество фон в этом анализе. Таким образом, эта модель широко используется поля с целью изучения ангиогенного влияние различных факторов и молекул. По сравнению с глазах некоторых крупных животных, таких как крысы и кролики, мыши глаза меньше и трудно справиться. Особое внимание Поэтому необходимо при выполнении этой модели, особенно в процессах создания кармана в роговице и вставки гранул. Нож должен быть обработан в точно контролируемым образом, чтобы он не прокол роговицы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Наше исследование опирается на Внутренние программы исследований NIH, Национального Института глаза.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R. Angiogenesis in the mouse cornea. Science. 205, 1416-1418 (1979).
- Ziche, M. Corneal assay for angiogenesis. Methods in molecular medicine. 46, 131-142 (2001).
- Ziche, M., Morbidelli, L. The corneal pocket assay. Methods in molecular biology. 467, 319-329 (2009).
