Summary
Hornhinnan är unik genom att den saknar vaskulära vävnader. Däremot kan robusta blodkärl tillväxt och överlevnad induceras i hornhinnan med potenta angiogena faktorer. Därför kan hornhinnan ge oss ett värdefullt verktyg för angiogena studier. Detta protokoll visar hur du utför den musmodell av hornhinnan fickan analysen och hur man bedömer angiogenes framkallas av angiogena hjälp av denna modell.
Abstract
En normal hornhinna är klart av vaskulära vävnader. Däremot kan blodkärlen förmås att växa och överleva i hornhinnan när potenta angiogena administreras 1. Denna unika har gjort hornhinnan fickan analys en av de mest använda modellerna för angiogenes studier. Hornhinnan komponerar flera lager av celler. Det är därför möjligt att bädda in en pellets som innehåller angiogena faktorn av intresse i hornhinnan för att utreda angiogena effekt 2,3. Här ger vi en steg för steg demonstration av hur man (jag) producera den angiogena faktorn som innehåller pellet (II) bädda in pelleten i hornhinnan (III) analysera angiogenes framkallas av den angiogena faktorn av intresse. Eftersom den grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF) är känd som en av de mest potenta angiogena 4, är det här används för att inducera angiogenes i hornhinnan.
Protocol
Alla utrustning och reagenser som används är sterila. Protokollet godkändes av Djurens skötsel och användning kommittén (ACUC) i NEI / NIH (djurstudie protokoll NEI-553), och utfördes enligt NIH riktlinjer och föreskrifter.
1. Att producera den angiogena faktorn som innehåller pellets
I denna del, är pellets som innehåller angiogena faktorn av intresse förberedd.
- Gör 10% (w / v) sukralfat lösning med PBS. Förvara i rumstemperatur.
- Gör 12% (w / v) poly-HEMA med absolut etanol. Förvara i rumstemperatur.
- Gör 1 mikrogram / l bFGF lösning. Förvaras i -80 ° C.
- För att göra 50 pellets, blanda 5 ìl av poly-HEMA, 1μl av sukralfat och 4 ìl bFGF stamlösning, virvel noggrant.
- Lägg en bit ren parafilm i en petriskål, utsätt den under UV-ljus i 15 min i en vävnadsodling huva. Drop 0,2 l av lösningen blandningen på parafilm för en pellets. Därför bör 10 ìl av lösningen blandningen avkastningen 50 pellets. Låt pellets torka i rumstemperatur i 1-2 timmar. Den torkade pellets kan förvaras i 4 ° C under flera dagar, eller -80 ° C under flera månader.
- Vid användning, bända och plocka upp pelletsen med tips av en pincett. Var extremt noga med att inte bryta dem eller göra dem våren bort.
2. Utföra musen analysen hornhinnan ficka
I denna del kommer vi att visa hur man gör en ficka i musen hornhinnan, och hur man sätter en pelletsbrännare i fickan. Den angiogena faktorn som finns i pelleten kommer att släppas efter hand till omkringliggande områden av hornhinnan (Bild 1). I denna demonstration använder vi 8-veckors kvinnliga C57/Bl6 möss.
- Musen är djupt systematiskt sövda med blandningen av ketamin (75 mg / kg) och xylazin (5mg/kg, ip injektion). Detta kommer att hålla musen under en narkos tillstånd för 30-60 min. Bedövningssalva (0,5% proparacaine HCl) appliceras på hornhinnan. Efter 5 min, fixa ena ögat under en dissekera mikroskop.
- En mycket mild sågas i mitten av hornhinnan 1,2 -1,4 mm från hornhinnan limbus (som visas i figur 1) med en von Graefe katarakt kniv. Var extremt noga med att inte skära igenom hornhinnan.
- En ficka görs under epitel lagret av hornhinnan genom att horisontellt sätta kniven i mitten av hornhinnan och förlängning kniven mot limbus försiktigt (figur 1). Storleken på fickan måste vara stora nog att rymma en angiogen faktor som innehåller pelleten. Var extremt noga med att inte punktera genom kornea.
- Sätt in en pellet med en pincett i fickan långsamt. Försök att göra pellets så platt som möjligt.
- Efter implantation av pellets, är ett ögonläkemedel antibiotisk salva i ögat. Instrumenten torkas med 70% spritsuddar mellan djur.
- Flytta musen till en varm och torr yta och övervaka den, tills den kan bibehålla en upprätt ställning och sedan tillbaka till sitt hem bur. Systemisk analgetika (t ex buprenorfin, 2 mg / kg, ip injektion) och aktuella antibiotika salva (t ex gentamicin) ges två gånger dagligen i 2 dagar efter operationen och musen är noga i 3 dagar. Healing förväntas avsluta inom de första 48 timmarna efter operationen. Ögat med i fickan kommer att undersökas under en slit-lampa biomicro utrymme mellan dag 4-10 efter pellets implantation.
3. Representativa resultat
- Sju dagar efter pelleten implantation, är musen bedövas systemiskt och lokalt som beskrivs i 2.1.
- Observera blodkärl i hornhinnan orsakas av den angiogena faktorn under en dissekera mikroskop. I hornhinnan som behandlas med fordon, kan ingen blodkärlstillväxt observeras (Fig. 2A, fordons-behandlade hornhinnan). I hornhinnan som behandlas med bFGF kan robusta angiogenes ses (Fig. 2B). Den blodkärlstillväxt kan bedömas med hjälp av den maximala längden av blodkärl (från det normala limbus fartyg till toppen av nya fartyg), och den totala blodet områden kärl (Fig. 2B, avgränsad med en streckad röd linje i bFGF -behandlade hornhinnan). Andra kvantifieringsmetoder har också beskrivits 2,5.
Figur 1. A. Normal hornhinnan med H & E färgning. Inga blodkärl finns i en normal hornhinna. B. Gör en ficka under epitel lagret av hornhinnan. C. Bädda in en pellet i fickan. D. Den angiogena faktorn frisätts från pellets och nya blodkärl växer från det normala limbus fartyg.
Figur 2. Representativt resultat fem dagar efter implantering av pelleten. A. Hornhinnan med en pellets som innehåller bilen bara. Inga nya blodkärl i hornhinnan. Endast de befintliga normala limbus fartyg är synliga. B. Hornhinnan med en pellet som innehåller bFGF. Robust nya blodkärl (dot-fodrade) ökade från redan existerande normala limbus fartyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Musen hornhinnan fickan test modell beskrevs första gången 1979 av Muthukkaruppan VR och Auerbach R 6. Detaljerade protokoll har publicerats av olika laboratorier 2,3,7,8. Vårt laboratorium har modifierat och använt denna metod i våra studier i många år 4. Musen hornhinnan fickan analysen är en relativt enkel modell med stor reproducerbarhet. En annan fördel med denna modell är att eftersom hornhinnan normalt saknar blodkärl, det finns minsta bakgrund i denna analys. Därför är denna modell som vanligen används av fältet för att studera angiogena effekten av olika faktorer och molekyler. Jämfört med ögonen hos en del större djur, som råttor och kaniner, musen ögonen är mindre och svåra att hantera. Särskild försiktighet krävs därför när du utför denna modell, speciellt vid processerna för att göra fickan i hornhinnan och sätta pelleten. Kniven måste hanteras på ett noggrant kontrollerat sätt så att den inte hål på hornhinnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vår forskning stöds av Interna forskningsprogram NIH, National Eye Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R.
- Ziche, M.
- Ziche, M., Morbidelli, L.
