血管新生研究のための角膜ポケットアッセイのマウスモデル

Summary

角膜は、血管組織を欠いている点でユニークです。しかし、堅牢な血管の成長と生存が強力な血管新生因子によって角膜に誘導することができる。そのため、角膜は私達と血管新生の研究のための貴重なツールを提供することができます。このプロトコルは、角膜のポケットアッセイのマウスモデルを実行する方法と、このモデルを用いて血管新生因子によって誘導される血管新生を評価する方法を示しています。

Abstract

正常な角膜は、血管組織の明らかである。しかし、血管は、強力な血管新生因子が^1を投与している角膜に成長し、生き残るために誘導することができる。この一意性は、角膜のポケットアッセイ血管新生の研究によく使われるモデルのひとつです。角膜は、セルの複数の層を構成する。それは、その血管新生効果^2,3を調査するために角膜への関心の血管新生因子を含むペレットを埋め込 ​​むことが可能である。ここで、我々は（私が）血管新生因子を含有するペレット（II）の（III）興味の血管新生因子によって誘導される血管新生を解析角膜にペレットを埋め込むを生成する方法のステップのデモンストレーションでステップを提供しています。塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）は最も強力な血管新生因子⁴の一つとして知られているので、角膜の血管新生を誘導するために使用されています。

Protocol

使用されるすべての機器や試薬は無菌である。プロトコルは、アニマルケアによって承認され、（動物実験のプロトコールNEI - 553）NEI / NIHで委員会（ACUC）を使用して、NIHのガイドラインと規則にしたがって実施した。

1。血管新生因子を含有するペレットを生産

この部分では、関心の血管新生因子を含むペレットを用意しています。

1. 10％（w / v）のPBSとスクラルファートのソリューションとなります。室温下で保管してください。
2. 無水エタノールで12％（w / v）のポリ- HEMAを行います。室温下で保管してください。
3. の1μg/μlのbFGFのソリューションとなります。 -80の℃で保存
4. 50ペレットを作るために、スクラルファートとbFGFのストック溶液4μlの1μlのポリ- HEMAの5μlを、、徹底的にボルテックスして混合する。
5. ペトリ皿の中できれいなパラフィルムの断片を配置する、組織培養フードで15分間UV光の下でそれを公開します。 oneペレット用パラフィルム上の混合溶液0.2μlをドロップします。このように、混合溶液の10μlを、50ペレットを生成する必要があります。 1〜2時間室温でペレットを乾燥させて。乾燥ペレットを数日間4℃に保存、または数ヶ月-80 ° Cすることができます。
6. 使用時には、てことピンセットの先端でペレットを拾う。それらを壊したり、それらを離れて跳ぶよう特に注意してください。

2。マウスの角膜のポケットアッセイを実行する

このパートでは、我々は、マウスの角膜でポケットを作る方法をデモンストレーションします、そしてポケットにペレットを挿入する方法。ペレットに含まれる血管新生因子は、角膜の周辺地域（図1）に徐々に放出されます。このデモでは、8週メスC57/BL6マウスを使用してください。

1. マウスは、ケタミン（75 mg / kg体重）及びキシラジン（5mg/kg、ip注射）の混合物と深く体系的に麻酔です。これは、30〜60分間麻酔の状態でマウスを保持します。局所麻酔薬（0.5％プロパラカイン塩酸）が角膜に適用されます。 5分後、解剖顕微鏡下で片目を修正。
2. 非常に穏やかなカットは、フォングレーフェ白内障ナイフで角膜輪部（図1に示す）から角膜1.2 -1.4 mmの途中で作られています。角膜を通して切らないように、特に注意してください。
3. ポケットは、水平に角膜の中央にナイフを挿入し、角膜輪部慎重に（図1）に向かってナイフを拡張することにより、角膜の上皮層の下に行われます。ポケットのサイズは1血管新生因子を含有するペレットを収容するために十分な大きさでなければなりません。角膜を介してではない穿刺には十分に注意してください。
4. ゆっくりポケットにピンセットでペレットを挿入します。可能な限りフラットとしてペレットを作ることを試みて下さい。
5. ペレットの注入後、局所眼科用抗生物質の軟膏を眼に適用されます。インストゥルメントは動物の間に70％のアルコールパッドで拭いています。
6. それは直立姿勢を維持し、そのホームケージにそれを返すことができるようになるまで、暖かく乾燥した領域にマウスを移動し、それを監視する。全身鎮痛薬（例えば、ブプレノルフィン、2 mg / kg投与、腹腔内注射）と局所抗生物質軟膏（例、ゲンタマイシン）手術後2日間1日2回与えられているとマウスが密接に3日間監視されています。ヒーリングは最初の48時間後に手術以内に完了する予定です。ポケット付きの目は、ペレットの移植後4日から10日間の細隙灯biomicroスコープで検査されるでしょう。

3。代表的な結果

1. ペレットを移植7日後、マウスに麻酔を全身および局所的に2.1で説明されているようです。
2. 解剖顕微鏡下で血管新生因子によって誘導される角膜の血管を観察します。車で治療角膜では、ない血管の成長は、（図2A、ビヒクル処理角膜）を観察することはできません。 bFGFで処理された角膜では、堅牢な血管新生は、（図2B）見ることができます。血管の成長は、血管（新しい血管の先頭に通常の輪部血管から）、および全血中の血管領域（図2Bは、bFGFの赤い破線で区切らの最大長を用いて評価することができる処理角膜）。他の定量法でも^2,5を記載されている。

図1。 H＆E染色と。正常な角膜。いいえ血管は正常な角膜には存在しません。B。角膜の上皮層の下にポケットを作る。C。ポケットにペレットを埋め込 ​​みます。D。血管新生因子は、ペレットから放出され、新しい血管は、通常の輪部血管から成長しています。

五日のIM後の図2。代表結果ペレットのプランテーション。。唯一の車両を含むペレットと角膜。角膜内に新しい血管の形成しません。唯一の既存の通常の輪部血管が表示されます。B。ペレットを含むbFGFと角膜。堅牢な新しい血管は、（ドット裏地）既存の通常の輪部血管から育った。

Discussion

マウスの角膜のポケットアッセイのモデルは、最初Muthukkaruppan VRとアウエルバッハR ⁶が1979年に記述されていた。詳細なプロトコルは、異なる研究室^2,3,7,8で公開されている。当研究室では長年⁴に変更され、我々の研究でこのメソッドを使用しています。マウスの角膜のポケットアッセイは非常に再現性を持つ比較的単純なモデルです。このモデルのもう一つの利点は、角膜は通常、血管がないので、このアッセイにおけるバックグラウンドの最小量があることです。したがって、このモデルは一般的に異なる要因と分子の血管新生作用を研究する分野で使用されます。このようなラットやウサギなどのいくつかのより大きい動物の目、と比較して、マウスの目は小さく、扱いが困難です。このモデルを実行する場合には、特別な注意は、したがって、特に角膜のポケットを作り、ペレットを挿入の過程において、要求される。ナイフは、それが穿刺角膜をしないように正確に制御された方法で処理する必要があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting microscope	World Precision Instruments, Inc.	PZMIV-BS
Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat)	Ambler Surgical	3401E
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-50
Slit lamp	Carl Zeiss, Inc.	30 SL-M
Table 1. Equipments
bFGF (basic fibroblast growth factor)	PeproTech Inc	100-18B
Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex)	Sigma-Aldrich	S0652	10% in PBS
poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate))	Sigma-Aldrich	P3932	12% in Ethanol
Table 2. Reagents and materials