Summary
القرنية هي فريدة من نوعها من حيث أنها تفتقر إلى أنسجة الأوعية الدموية. ومع ذلك ، يمكن أن يكون ذلك حافزا قويا نمو الاوعية الدموية والبقاء في القرنية بسبب عوامل عائية قوية. لذلك ، يمكن للقرنية توفير معنا أداة قيمة للدراسات عائية. هذا البروتوكول يوضح كيفية تنفيذ نموذج الفأر من مقايسة جيب القرنية وكيفية تقييم الأوعية الدموية التي تسببها عوامل عائية باستخدام هذا النموذج.
Abstract
والقرنية الطبيعي هو واضح للأنسجة الأوعية الدموية. ومع ذلك ، يمكن أن يتسبب الأوعية الدموية على النمو والبقاء على قيد الحياة في القرنية عندما تدار عائية العوامل القوية 1. وقد جعل هذا التفرد في مقايسة القرنية جيب واحد من النماذج الأكثر استخداما للدراسات الأوعية الدموية. القرنية يؤلف عدة طبقات من الخلايا. ولذلك فمن الممكن تضمين بيليه الذي يحتوي على عامل عائية من الاهتمام في القرنية للتحقيق في تأثيره 2،3 عائية. هنا ، ونحن نقدم خطوة خطوة من خلال مظاهرة لكيفية (I) تنتج عامل المحتوية عائية بيليه (II) تضمين بيليه في القرنية (III) تحليل الأوعية الدموية الناجمة عن معامل عائية من الفائدة. ومن المعروف منذ نمو الخلايا الليفية الأساسية عامل (bFGF) باعتباره واحدا من العوامل عائية أقوى 4 ، يتم استخدامه هنا للحث على الأوعية الدموية في القرنية.
Protocol
جميع المعدات والكواشف المستخدمة معقمة. وكان البروتوكول التي وافقت عليها رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (لاعب) في NEI / المعاهد الوطنية للصحة (الحيوان بروتوكول الدراسة NEI - 553) ، وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة واللوائح.
1. إنتاج عامل عائية تحتوي على كريات
في هذا الجزء ، يتم إعداد الكريات تحتوي على عامل عائية من الفائدة.
- جعل 10 ٪ (W / V) حل sucralfate مع برنامج تلفزيوني. مخزن تحت درجة حرارة الغرفة.
- جعل 12 ٪ (W / V) بولي HEMA مع الايثانول المطلق. مخزن تحت درجة حرارة الغرفة.
- جعل 1 ميكروغرام / ميكرولتر حل bFGF. متجر في -80 درجة مئوية.
- لجعل 50 الكريات ، ومزيج 5 ميكرولتر من البولي HEMA ، 1μl من sucralfate و 4 ميكرولتر من محلول المخزون bFGF ، دوامة بدقة.
- ضع قطعة من parafilm نظيفة في طبق بتري ، تعريضها للأشعة فوق البنفسجية تحت الضوء لمدة 15 دقيقة في نسيج الثقافة هود. انخفاض 0.2 ميكرولتر من الخليط على حل لأحد parafilm بيليه. وبالتالي ، ينبغي 10 ميكرولتر من الخليط حل الغلة 50 الكريات. السماح للالكريات الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعات. ويمكن تخزين كريات المجففة في 4 درجة مئوية لعدة أيام ، أو -80 درجة مئوية لعدة أشهر.
- عند الاستخدام ، ونقب والتقاط الكرات مع نصائح للزوج من الملقط. نكون حذرين للغاية ليس لكسر لهم أو جعلها الربيع بعيدا.
2. أداء جيب القرنية مقايسة الماوس
في هذا الجزء ، سوف نقوم شرح كيفية جعل جيب الماوس في القرنية ، وكيفية ادخال وبيليه في الجيب. وسوف يتم الافراج عن عامل عائية الواردة في بيليه تدريجيا الى المناطق المحيطة بها من القرنية (الشكل 1). في هذه المظاهرة ، ونحن نستخدم 8 أسابيع الإناث C57/Bl6 الفئران.
- الفأر هو تخدير عميق بشكل منتظم مع خليط من الكيتامين (75 ملغ / كلغ) وزيلازين (5mg/kg ، حقن IP). هذا وسوف تبقي الماوس تحت التخدير للدولة 30-60 دقيقة. يتم تطبيق مخدر موضعي (0.5 ٪ بروباراكايين حمض الهيدروكلوريك) إلى القرنية. بعد 5 دقائق ، وإصلاح عين واحدة تحت المجهر تشريح.
- يتم إجراء خفض لطيف جدا في منتصف القرنية -1.4 1.2 ملم من حوف القرنية (كما هو موضح في الشكل 1) بسكين فون ساد غريف. نكون حذرين للغاية على عدم قطع طريق القرنية.
- يتم إجراء جيب تحت طبقة ظهارة القرنية عن طريق إدراج أفقيا السكين في منتصف القرنية وتمتد نحو السكين بعناية حوف (Fig.1). حجم الجيب يجب أن تكون كبيرة بما يكفي لاستيعاب أحد العوامل التي تحتوي على عائية بيليه. نكون حذرين للغاية ليس لثقب من خلال القرنية.
- اضافة الى وجود بيليه مع زوج من الملقط في جيب ببطء. محاولة لجعل بيليه كما شقة ممكن.
- بعد زرع بيليه ، يتم تطبيق مرهم مضاد حيوي موضعي للعين للعين. يتم محو الصكوك مع منصات الكحول 70 ٪ بين الحيوانات.
- تحريك الماوس إلى منطقة دافئة وجافة ورصد ذلك ، حتى أنها قادرة على الحفاظ على تستقيم الموقف ثم إعادته إلى وطنه القفص. تعطى المسكنات النظامية (على سبيل المثال ، البوبرينورفين ، 2 ملغ / كغ ، وحقن IP) ومرهم مضاد حيوي موضعي (مثل جنتاميسين) مرتين يوميا لمدة 2 بعد أيام من الجراحة ، وتراقب عن كثب الماوس لمدة 3 أيام. ومن المتوقع لإتمام الشفاء في غضون ال 48 ساعة الأولى بعد الجراحة. وسيتم فحص العين مع الجيب تحت نطاق biomicro الشق مصباح بين 4-10 يوما بعد زرع بيليه.
3. ممثل النتائج
- بعد سبعة أيام من زرع بيليه ، والفأر هو تخدير موضعي وبشكل منتظم كما هو موضح في 2.1.
- مراقبة الأوعية الدموية في القرنية الناجمة عن معامل عائية تشريح تحت المجهر. في القرنية تعامل مع السيارة ، ويمكن ملاحظة وجود نمو الاوعية الدموية (الشكل 2A ، مركبة المعاملة القرنية). في القرنية تعامل مع bFGF ، يمكن اعتبار قوي الأوعية الدموية (الشكل 2B). ويمكن تقييم نمو الأوعية الدموية باستخدام الحد الأقصى لطول الأوعية الدموية (من السفن الحوفي الطبيعي أن الجزء العلوي من السفن الجديدة) ، والأوعية الدموية مجموع المناطق (الشكل 2B ، يرسم مع خط أحمر متقطع في bFGF المعالجة القرنية). أساليب القياس الكمي الأخرى كما وصفت 2،5.
الشكل 1. والقرنية. عادي مع H & E تلطيخ. لا توجد الأوعية الدموية في القرنية الطبيعية. باء. جعل جيب تحت طبقة ظهارة القرنية. C. تضمين بيليه في الجيب. D. يتم إطلاق سراح عامل عائية من بيليه ، وأوعية دموية جديدة تنمو من السفن العادية الحوفي.
الشكل 2. الممثل النتيجة بعد خمسة أيام من ايممزرعة لبيليه. A. القرنية مع بيليه الذي يحتوي على السيارة فقط. أي تشكيل اوعية دموية جديدة في القرنية. فقط موجودة من قبل السفن العادية الحوفي مرئية. باء. القرنية مع bFGF تحتوي على بيليه. نمت أوعية دموية جديدة قوية (نقطة مبطنة) من السفن الموجودة من قبل الحوفي العادي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكان أول وصف الجيب القرنية الفأر نموذج الفحص في عام 1979 من قبل VR Muthukkaruppan وأورباخ R 6. وقد نشرت البروتوكولات مفصلة من قبل مختبرات مختلفة 2،3،7،8. عدلت مختبرنا وتستخدم هذه الطريقة في دراساتنا لسنوات عديدة 4. جيب القرنية فحص الفأر هو نموذج بسيط نسبيا مع استنساخ كبير. ميزة أخرى لهذا النموذج هو أنه منذ القرنية تفتقر عادة الأوعية الدموية ، وليس هناك حد أدنى من الخلفية في هذا الاختبار. لذلك ، ويشيع استخدام هذا النموذج من حقل لدراسة تأثير العوامل المختلفة من عائية والجزيئات. بالمقارنة مع وجهة نظر بعض الحيوانات الكبيرة ، مثل الفئران والأرانب ، والعيون هي أصغر ماوس ويصعب التعامل معها. وعليه لا بد رعاية خاصة عند تنفيذ هذا النموذج ، وخصوصا خلال عمليات صنع الجيب في القرنية وإدراج بيليه. ويجب التعامل مع السكين في الطريقة التي تسيطر عليها بدقة بحيث لا ثقب القرنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويدعم بحثنا عن برنامج بحوث جماعية لل، المعاهد الوطنية للصحة المعهد الوطني للعيون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R.
- Ziche, M.
- Ziche, M., Morbidelli, L.
