Summary
La cornea è unico in quanto manca di tessuti vascolari. Tuttavia, una robusta crescita dei vasi sanguigni e la sopravvivenza può essere indotta nella cornea da potenti fattori angiogenici. Pertanto, la cornea in grado di fornire con noi uno strumento prezioso per gli studi angiogenico. Questo protocollo illustra come eseguire il modello murino di test cornea tasca e come valutare l'angiogenesi indotta da fattori angiogenici utilizzando questo modello.
Abstract
Una cornea normale è chiaro dei tessuti vascolari. Tuttavia, i vasi sanguigni possono essere indotte a crescere e sopravvivere nella cornea quando potenti fattori angiogenici sono amministrati 1. Questa unicità ha fatto il test tasca cornea uno dei modelli più utilizzati per gli studi di angiogenesi. La cornea compone di più strati di cellule. E 'quindi possibile incorporare un pellet contenente il fattore angiogenico di interesse nella cornea per indagare l'effetto angiogenico 2,3. Qui, mettiamo a disposizione una dimostrazione passo passo su come (I) produrre il fattore angiogenico contenenti pellet (II) incorporare il pellet nella cornea (III) analizzare l'angiogenesi indotta dal fattore angiogenico di interesse. Dato che la base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF) è noto come uno dei più potenti fattori angiogenici 4, è qui usato per indurre l'angiogenesi nella cornea.
Protocol
Tutte le attrezzature e reagenti utilizzati sono sterili. Il protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e utilizzo Comitato (ACUC) al NEI / NIH (protocollo di studio su animali NEI-553), ed è stata eseguita secondo le linee guida NIH e regolamenti.
1. Produrre il fattore angiogenico contenenti pellet
In questa parte, il pellet contenente il fattore angiogenico di interesse sono preparati.
- Prova del 10% (w / v) di sucralfato con PBS. Conservare a temperatura ambiente.
- Fai 12% (w / v) poli-HEMA con etanolo assoluto. Conservare a temperatura ambiente.
- Fare 1 mg / soluzione bFGF microlitri. Conservare a -80 ° C.
- Per fare 50 palline, mescolare 5 ml di poli-HEMA, 1ml di sucralfato e 4 ml di soluzione madre bFGF, vortice accuratamente.
- Posizionare un pezzo di parafilm pulita in una capsula di Petri, esporla ai raggi UV per 15 minuti in una cappa di coltura di tessuti. Goccia 0,2 microlitri della miscela soluzione sul parafilm per un pellet. Così, 10 microlitri della miscela soluzione dovrebbe produrre 50 pellet. Lasciate asciugare il pellet a temperatura ambiente per 1-2 ore. Il pellet essiccato possono essere memorizzati in 4 ° C per diversi giorni, o -80 ° C per diversi mesi.
- Al momento dell'utilizzo, leva e raccogliere le palline con le punte di un paio di pinze. Fare molta attenzione a non romperli o di farli primavera distanza.
2. Esecuzione della cornea saggio topo tasca
In questa parte, mostreremo come fare una tasca nella cornea del mouse, e come inserire una pallina nella tasca. Il fattore angiogenico contenuta nel pellet verrà rilasciata gradualmente alle zone circostanti della cornea (Fig. 1). In questa dimostrazione, si usa di 8 settimane femmina C57/Bl6 topi.
- Il mouse è profondamente anestetizzati sistematicamente con la miscela di ketamina (75 mg / kg) e xilazina (5mg/kg, iniezione ip). Ciò manterrà il mouse in uno stato di anestesia per 30-60 min. Anestetico locale (0,5% proparacaina HCl) viene applicato alla cornea. Dopo 5 minuti, fissare un occhio sotto un microscopio da dissezione.
- Un taglio molto delicato è nel bel mezzo della cornea 1,2 -1,4 mm dal limbus corneale (come illustrato nella figura 1) con un coltello von Graefe cataratta. Fare molta attenzione a non tagliare la cornea.
- Una tasca è fatto sotto lo strato epitelio della cornea da parte orizzontalmente inserendo il coltello verso il centro della cornea ed estendendo il coltello verso la cura limbus (Fig.1). La dimensione della tasca deve essere abbastanza grande per ospitare una fattore angiogenico contenenti pellet. Fare molta attenzione a non forare attraverso la cornea.
- Inserire un pellet con una pinza nella tasca lentamente. Provate a fare il pellet più piatta possibile.
- Dopo l'impianto di pellet, un argomento di attualità pomata oftalmica antibiotica viene applicato per l'occhio. Gli strumenti sono puliti con tamponi imbevuti di alcool al 70% tra gli animali.
- Muovi il mouse in una zona calda e secca e monitorarlo, fino a quando non è in grado di mantenere una postura eretta e poi tornare alla sua gabbia casa. Analgesici sistemici (es. buprenorfina, 2 mg / kg, iniezione ip) e di attualità pomata antibiotica (es. gentamicina) sono dati due volte al giorno per 2 giorni dopo l'intervento e il mouse è strettamente monitorati per 3 giorni. La guarigione è previsto di completare entro le prime 48 ore post-intervento chirurgico. L'occhio con la tasca saranno esaminate sotto un lampada a fessura portata biomicro tra i giorni 4-10 dopo l'impianto a pellet.
3. Rappresentante risultati
- Sette giorni dopo l'impianto a pellet, il mouse è anestetizzato sistemico e topico, come descritto al punto 2.1.
- Osservare i vasi sanguigni nella cornea indotta dal fattore angiogenico sotto un microscopio da dissezione. Nella cornea trattata con veicolo, non la crescita dei vasi sanguigni possono essere osservati (Fig. 2A, veicoli trattati con cornea). Nella cornea trattata con bFGF, angiogenesi robusta può essere visto (Fig. 2B). La crescita dei vasi sanguigni può essere valutato utilizzando la lunghezza massima dei vasi sanguigni (dai vasi normali limbare alla parte superiore dei vasi nuovi), e il totale aree vaso sanguigno (Fig. 2B, delineato da una linea rossa tratteggiata nel bFGF trattati con cornea). Altri metodi di quantificazione sono stati descritti anche 2,5.
Figura 1. A. Cornea normale con colorazione H & E. Nessun vaso sanguigno esiste in una cornea normale. B. Fai una tasca al di sotto dello strato epitelio della cornea. C. Incorpora una pallina nella tasca. D. Il fattore angiogenico viene rilasciato dal pellet, e crescere nuovi vasi sanguigni dai vasi normali limbari.
Figura 2. Risultato Rappresentante cinque giorni dopo l'impiantagione del pellet. Un. Cornea con un pellet contenente il solo veicolo. Nessuna nuova formazione dei vasi sanguigni nella cornea. Solo i vasi normali preesistenti limbari sono visibili. B. Cornea con un pellet contenente bFGF. Robusto nuovi vasi sanguigni (dot-allineati) sono cresciuti dai vasi normali preesistenti limbare.
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Discussion
La cornea del mouse modello tascabile test è stato descritto nel 1979 da Muthukkaruppan VR e Auerbach R 6. Protocolli dettagliati sono stati pubblicati da diversi laboratori 2,3,7,8. Il nostro laboratorio ha modificato e utilizzato questo metodo nei nostri studi per molti anni 4. La cornea saggio topo tasca è un modello relativamente semplice, con grande riproducibilità. Un altro vantaggio di questo modello è che, poiché la cornea non ha vasi sanguigni in genere, non c'è importo minimo di esperienza in questo saggio. Pertanto, questo modello è comunemente usato per il campo per studiare l'effetto di diversi fattori angiogenici e molecole. Confrontato con gli occhi di alcuni animali più grandi, come i ratti e conigli, gli occhi del mouse sono più piccoli e difficili da gestire. Particolare cura è quindi necessaria durante l'esecuzione di questo modello, in particolare durante i processi di rendere la tasca nella cornea e inserendo il pellet. Il coltello deve essere gestita in maniera controllata con precisione in modo che non forare la cornea.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
La nostra ricerca è sostenuta dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Eye Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R. Angiogenesis in the mouse cornea. Science. 205, 1416-1418 (1979).
- Ziche, M. Corneal assay for angiogenesis. Methods in molecular medicine. 46, 131-142 (2001).
- Ziche, M., Morbidelli, L. The corneal pocket assay. Methods in molecular biology. 467, 319-329 (2009).
