Summary
A córnea é o único que carece de tecidos vasculares. No entanto, o crescimento dos vasos sanguíneos e robusta sobrevivência pode ser induzida na córnea de potentes fatores angiogênicos. Portanto, a córnea pode fornecer-nos com uma ferramenta valiosa para estudos angiogênico. Este protocolo demonstra como executar o modelo do rato de ensaio de córnea bolso e como avaliar a angiogênese induzida por fatores angiogênicos usando este modelo.
Abstract
A córnea normal é claro de tecidos vasculares. No entanto, os vasos sanguíneos podem ser induzidos a crescer e sobreviver na córnea quando potentes fatores angiogênicos são administrados 1. Esta singularidade fez com que o ensaio de bolso córnea um dos modelos mais utilizados para estudos de angiogênese. A córnea compõe de várias camadas de células. Portanto, é possível incorporar um pellet contendo o fator angiogênico de interesse na córnea para investigar seu efeito angiogênico 2,3. Aqui, fornecemos uma demonstração passo a passo de como (I) produzir o fator angiogênico contendo pellet (II) incorporar a pelota para a córnea (III) analisar a angiogênese induzida pelo fator angiogênico de interesse. Uma vez que o fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) é conhecido como um dos fatores mais potente angiogênico 4, é usado aqui para induzir angiogênese na córnea.
Protocol
Todos os equipamentos e reagentes utilizados são estéreis. O protocolo foi aprovado pelo Animal Care e Use Committee (ACUC) no NEI / NIH (animal protocolo de estudo NEI-553), e foi realizada de acordo com as diretrizes do NIH e regulamentos.
1. Produzir o fator angiogênico contendo pellets
Nesta parte, os pellets contendo o fator angiogênico de interesse estão preparados.
- Fazer 10% (w / v) solução de sucralfato com PBS. Loja sob temperatura ambiente.
- Faça 12% (w / v) de poli-HEMA com etanol absoluto. Loja sob temperatura ambiente.
- Fazer 1 mg / mL solução bFGF. Loja em -80 ° C.
- Para fazer 50 pellets, mistura de 5 mL de poli-HEMA, 1μl de sucralfato e 4 mL de bFGF solução estoque, vortex completamente.
- Coloque um pedaço de parafilme limpa em uma placa de Petri, expô-la sob a luz UV por 15 min em uma capa de cultura de tecidos. Queda de 0,2 mL da mistura de solução no parafilme para uma pelota. Assim, 10 ml da mistura de solução deve render 50 pellets. Deixe o pellets secos em temperatura ambiente por 1-2 horas. Os pellets secos podem ser armazenados em 4 oC durante vários dias ou -80 ° C durante vários meses.
- Após o uso, bisbilhotar e pegar as bolinhas com as pontas de um par de fórceps. Ser extremamente cuidadoso para não quebrá-las ou torná-las fonte de distância.
2. Executando o mouse ensaio bolso córnea
Nesta parte, iremos demonstrar como fazer um bolso na córnea do rato, e como inserir um pellet no bolso. O fator angiogênico contidas no pellet será liberado gradualmente para as áreas circundantes da córnea (Fig. 1). Nesta demonstração, utilizamos 8 semanas feminino C57/Bl6 camundongos.
- O mouse está profundamente sistematicamente anestesiados com a mistura de cetamina (75 mg / kg) e xilazina (5mg/kg, injeção ip). Isto irá manter o mouse sob um estado de anestesia por 30-60 min. Anestésico tópico (0,5% proximetacaína HCl) é aplicada à córnea. Após 5 min, corrigir um olho em um microscópio de dissecação.
- Um corte muito suave é feita no meio da córnea 1,2 -1,4 mm do limbo da córnea (como ilustrado na Figura 1) com uma faca von Graefe de catarata. Ser extremamente cuidadoso para não cortar através da córnea.
- Um bolso é feita sob a camada do epitélio da córnea por horizontalmente inserindo a faca no meio da córnea e estendendo a faca em direção ao cuidado limbo (Fig.1). O tamanho do bolso tem que ser grande o suficiente para acomodar um fator angiogênico contendo pellet. Ser extremamente cuidadoso para não perfurar através da córnea.
- Inserir uma pelota com um par de fórceps no bolso lentamente. Tente fazer o pellet o mais plano possível.
- Após o implante do pellet, uma pomada antibiótica tópica oftálmica é aplicado no olho. Instrumentos são limpos com compressas embebidas em álcool 70% entre os animais.
- Mova o mouse para uma área quente e seco e monitorá-lo, até que ele é capaz de manter uma postura ereta e depois devolvê-lo à sua gaiola. Analgésicos sistêmicos (por exemplo, buprenorfina, 2 mg / kg, injeção ip) e pomada antibiótica tópica (por exemplo, gentamicina) são dadas duas vezes por dia durante 2 dias após a cirurgia eo mouse é acompanhada de perto por 3 dias. A cura é o esperado para concluir dentro das primeiras 48 horas pós-cirurgia. O olho com o bolso vai ser analisada sob um escopo biomicro lâmpada de fenda entre os dias 10/04 após a implantação da pelota.
3. Resultados representativos
- Sete dias após a implantação da pelota, o mouse é anestesiado sistemicamente e topicamente, conforme descrito em 2.1.
- Observar os vasos sanguíneos na córnea induzida pelo fator angiogênico sob um microscópio de dissecação. Na córnea tratado com veículo, não o crescimento dos vasos sanguíneos pode ser observado (Fig. 2A, veículo-tratados córnea). Na córnea tratado com bFGF, angiogênese robusta pode ser visto (Fig. 2B). O crescimento dos vasos sanguíneos podem ser avaliados usando o comprimento máximo dos vasos sanguíneos (dos vasos normais limbo ao topo das novas embarcações), e as áreas de sangue total do vaso (Fig. 2B, delineados com uma linha vermelha tracejada no bFGF tratados com córnea). Métodos de quantificação outros também têm sido descritos 2,5.
Figura 1. A córnea. Normal com H & E coloração. Nenhuma embarcação de sangue existe em uma córnea normal. B. Faça um bolso debaixo da camada do epitélio da córnea. C. Incorporar um pellet no bolso. D. O fator angiogênico é liberado do sedimento, e novos vasos sanguíneos crescem a partir do limbo vasos normais.
Figura 2. Resultado Representante cinco dias após a implantação do sedimento. A. Córnea com um pellet contendo o único veículo. Não há formação de novos vasos sanguíneos na córnea. Apenas os pré-existentes normais vasos limbo são visíveis. B. Córnea com uma bFGF contendo pellet. Robusta novos vasos sanguíneos (dot-lined) cresceu a partir do pré-existentes normais vasos limbo.
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Discussion
O mouse córnea modelo de ensaio de bolso foi descrita pela primeira vez em 1979 por Muthukkaruppan VR e Auerbach R 6. Protocolos detalhados foram publicados por diferentes laboratórios 2,3,7,8. Nosso laboratório tem modificado e utilizado este método em nossos estudos por muitos anos 4. O mouse ensaio bolso córnea é um modelo relativamente simples, com grande reprodutibilidade. Outra vantagem deste modelo é que desde que a córnea não tem vasos sanguíneos, normalmente, não há quantidade mínima de fundo neste ensaio. Portanto, este modelo é comumente usado pelo campo para estudar o efeito de fatores angiogênicos e moléculas diferentes. Comparado com os olhos de alguns animais de maior porte, como ratos e coelhos, os olhos do rato são menores e mais difíceis de lidar. Cuidados especiais são necessários, portanto, ao executar este modelo, especialmente durante os processos de tomada do bolso na córnea e inserindo o sedimento. A faca deve ser tratado de uma maneira controlada com precisão para que ele não irá perfurar a córnea.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Nossa pesquisa é apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do, NIH National Eye Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R.
- Ziche, M.
- Ziche, M., Morbidelli, L.
