Summary
कॉर्निया है कि यह संवहनी ऊतकों का अभाव अद्वितीय है. हालांकि, मजबूत रक्त वाहिका विकास और अस्तित्व के कॉर्निया में शक्तिशाली angiogenic कारकों द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. इसलिए, कॉर्निया हमारे साथ angiogenic अध्ययन के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे कॉर्निया जेब परख और कैसे करने के लिए इस मॉडल का उपयोग करके angiogenic कारकों द्वारा प्रेरित angiogenesis आकलन के माउस मॉडल का प्रदर्शन करने के लिए.
Abstract
संवहनी ऊतकों की एक सामान्य कॉर्निया स्पष्ट है. हालांकि, रक्त वाहिकाओं बढ़ने और कॉर्निया जब शक्तिशाली angiogenic कारकों 1 प्रशासित रहे हैं में जीवित रहने के लिए प्रेरित किया जा सकता है. यह विशिष्टता कॉर्निया जेब परख angiogenesis के अध्ययन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया मॉडल बना दिया है. कॉर्निया कोशिकाओं की कई परतों के composes. इसलिए यह संभव है एक गोली अपने angiogenic 2,3 प्रभाव की जांच करने के लिए कॉर्निया में ब्याज की angiogenic कारक युक्त एम्बेड. यहाँ, हम कैसे (मैं) angiogenic कारक युक्त गोली (द्वितीय) कॉर्निया में गोली एम्बेड (iii) ब्याज की angiogenic पहलू द्वारा प्रेरित angiogenesis विश्लेषण का उत्पादन कदम प्रदर्शन के द्वारा एक कदम प्रदान करते हैं. चूंकि बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) एक सबसे शक्तिशाली angiogenic कारकों 4 के रूप में जाना जाता है, यह यहां इस्तेमाल किया है कॉर्निया में angiogenesis प्रेरित .
Protocol
सभी उपकरणों और अभिकर्मकों बाँझ कर रहे हैं. प्रोटोकॉल जानवर की देखभाल के द्वारा अनुमोदित किया गया था और Nei / NIH पर समिति (ACUC) का उपयोग करें (पशु अध्ययन प्रोटोकॉल Nei-553), गया था और NIH दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार किया.
1. Angiogenic कारक युक्त छर्रों का उत्पादन
इस भाग में, ब्याज की angiogenic कारक युक्त छर्रों लिए तैयार हैं.
- 10% (w / v) PBS के साथ sucralfate समाधान करें. कमरे के तापमान के तहत स्टोर.
- 12% (w / v) पाली - हेमा निरपेक्ष इथेनॉल के साथ बनाओ. कमरे के तापमान के तहत स्टोर.
- 1 μg / μl bFGF समाधान करें. -80 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
- 50 छर्रों बनाने के लिए, पाली - हेमा के 5 μl, sucralfate और bFGF शेयर समाधान के 4 μl के 1μl, अच्छी तरह भंवर मिश्रण.
- एक पेट्री डिश में साफ parafilm का एक टुकड़ा प्लेस, यूवी प्रकाश के तहत यह एक टिशू कल्चर हुड में 15 मिनट के लिए बेनकाब. Parafilm के लिए एक गोली पर समाधान मिश्रण का 0.2 μl गिरा. इस प्रकार, समाधान मिश्रण के 10 μl 50 छर्रों उपज चाहिए. 1-2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क छर्रों चलो. सूखे छर्रों कई दिनों ° कई महीनों के लिए सी -80 या के लिए 4 oC में संग्रहीत किया जा सकता है.
- उपयोग करने पर, जिज्ञासा और संदंश की एक जोड़ी के सुझावों के साथ छर्रों लेने. अत्यंत उन्हें नहीं तोड़ या उन्हें दूर वसंत सावधान रहें.
2. माउस कॉर्निया जेब परख प्रदर्शन
इस भाग में, हम कैसे माउस कॉर्निया में एक जेब बनाने के लिए प्रदर्शन, और कैसे जेब में डालने के लिए एक गोली. angiogenic गोली में निहित कारक कॉर्निया के आसपास के क्षेत्रों (1 छवि) के लिए धीरे - धीरे जारी किया जाएगा. इस प्रदर्शन में, हम 8 सप्ताह के महिला C57/Bl6 चूहों का उपयोग करें.
- माउस गहरा व्यवस्थित ketamine (75 मिग्रा / किग्रा) और xylazine (5mg/kg, आईपी इंजेक्शन) के मिश्रण के साथ anesthetized है. यह एक संज्ञाहरण के तहत राज्य 30-60 मिनट के लिए माउस रखेंगे. सामयिक चतनाशून्य करनेवाली औषधि (0.5% proparacaine एचसीएल) कॉर्निया को लागू किया जाता है. 5 मिनट के बाद, एक विदारक खुर्दबीन के नीचे एक आँख को ठीक.
- एक बहुत ही सौम्य काट कॉर्निया वॉन Graefe मोतियाबिंद चाकू के साथ corneal किनारी (के रूप में चित्रा 1 में सचित्र) से 1.2 -1.4 मिमी के बीच में किया जाता है. अत्यंत कॉर्निया के माध्यम से कटौती नहीं सावधान रहो.
- एक जेब कॉर्निया के उपकला परत के नीचे क्षैतिज कॉर्निया के बीच में चाकू डालने और किनारी सावधानी से (Fig.1) की ओर चाकू देने के द्वारा बनाई गई है. जेब के आकार काफी बड़ा है एक angiogenic कारक युक्त गोली को समायोजित किया जाना है. अत्यंत कॉर्निया के माध्यम से पंचर करने के लिए नहीं सावधान रहो.
- धीरे जेब में संदंश की एक जोड़ी के साथ एक गोली डालें. फ्लैट के रूप में संभव के रूप में गोली बनाने की कोशिश करें.
- गोली के आरोपण के बाद, आंख के लिए एक सामयिक नेत्र एंटीबायोटिक मलहम लागू किया जाता है. उपकरण 70% पशुओं के बीच शराब पैड के साथ नष्ट कर रहे हैं.
- एक गर्म और शुष्क क्षेत्र के लिए माउस ले जाएँ और यह निगरानी, जब तक यह एक ईमानदार मुद्रा बनाए रखने के लिए और फिर इसे अपने घर पिंजरे के लिए वापस करने में सक्षम है. प्रणालीगत (उदाहरण के लिए, buprenorphine, 2 मिलीग्राम / किलो, आईपी इंजेक्शन) दर्दनाशक दवाओं और सामयिक एंटीबायोटिक मरहम (जैसे gentamicin) 2 दिनों के लिए दो बार दैनिक दिया जाता है और सर्जरी के बाद माउस बारीकी से 3 दिनों के लिए नजर रखी है. हीलिंग के लिए पहले 48 घंटे के बाद सर्जरी के भीतर पूरा होने की उम्मीद है. जेब के साथ आँख गोली आरोपण के बाद 4-10 दिन के बीच एक भट्ठा दीपक BioMicro गुंजाइश के तहत जांच की जाएगी.
3. प्रतिनिधि परिणाम
- गोली आरोपण के बाद सात दिनों, माउस anesthetized प्रणालीबद्ध और topically के रूप में 2.1 में वर्णित है.
- कॉर्निया में रक्त वाहिकाओं angiogenic कारक द्वारा प्रेरित एक विदारक खुर्दबीन के नीचे देखो. वाहन के साथ इलाज कॉर्निया में कोई रक्त वाहिका विकास (छवि 2A, वाहन का इलाज कॉर्निया) मनाया जा सकता है. BFGF के साथ इलाज कॉर्निया में मजबूत angiogenesis (छवि 2B) देखा जा सकता है. रक्त वाहिका विकास रक्त वाहिकाओं (नई वाहिकाओं के शीर्ष करने के लिए सामान्य अंगीय वाहिकाओं से), और कुल रक्त वाहिका क्षेत्रों (छवि 2B, bFGF में एक लाल डैश्ड लाइन के साथ चित्रित की अधिकतम लंबाई का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता है है कॉर्निया का इलाज). अन्य मात्रा का ठहराव के तरीके भी 2,5 वर्णित किया गया है.
चित्रा 1. एच एंड ई धुंधला के साथ एक सामान्य कॉर्निया . कोई रक्त वाहिका एक सामान्य कॉर्निया में मौजूद बी. कॉर्निया की सी. उपकला परत के नीचे एक जेब बनाओ. जेब में एक गोली एम्बेड डी.. angiogenic कारक गोली से जारी है, और सामान्य अंगीय वाहिकाओं से नए रक्त वाहिकाओं बढ़ने.
चित्रा 2 im पांच दिन के बाद प्रतिनिधि परिणाम.गोली के एक बागान. एक वाहन केवल युक्त गोली के साथ कॉर्निया. कॉर्निया में कोई नई रक्त वाहिनियों के गठन. केवल पूर्व मौजूदा सामान्य अंगीय वाहिकाओं दिखाई दे रहे हैं बी. एक गोली युक्त bFGF के साथ कॉर्निया. मजबूत नए रक्त वाहिकाओं (डॉट लाइन) पूर्व मौजूदा सामान्य अंगीय वाहिकाओं से वृद्धि हुई.
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Discussion
माउस कॉर्निया जेब परख मॉडल पहले Muthukkaruppan वी.आर. और Auerbach अनुसंधान 6 द्वारा 1979 में वर्णित किया गया था. विस्तृत प्रोटोकॉल अलग 2,3,7,8 प्रयोगशालाओं द्वारा प्रकाशित किया गया है. हमारी प्रयोगशाला संशोधित और कई 4 साल के लिए हमारे अध्ययन में इस विधि का इस्तेमाल किया. माउस कॉर्निया जेब परख महान reproducibility के साथ एक अपेक्षाकृत सरल मॉडल है. इस मॉडल का एक अन्य लाभ यह है कि के बाद कॉर्निया सामान्य रक्त वाहिकाओं का अभाव है, वहाँ इस परख में पृष्ठभूमि की न्यूनतम राशि है. इसलिए, इस मॉडल सामान्यतः विभिन्न कारकों और अणुओं के angiogenic प्रभाव का अध्ययन करने के लिए क्षेत्र द्वारा किया जाता है. चूहों और खरगोशों जैसे कुछ बड़े जानवरों की आंखों के साथ तुलना में, माउस आँखें छोटे और संभालना बहुत मुश्किल हैं. इसलिए विशेष देखभाल जब कॉर्निया में जेब बनाने और गोली डालने की प्रक्रिया के दौरान विशेष रूप से इस मॉडल, प्रदर्शन की आवश्यकता है. चाकू एक ठीक नियंत्रित तरीके से संभाला जाना चाहिए इतना है कि यह कॉर्निया पंचर नहीं होगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हमारे शोध एनआईएच, राष्ट्रीय नेत्र संस्थान के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R.
- Ziche, M.
- Ziche, M., Morbidelli, L.
