Summary
多种生长因子和蛋白质相互作用，从而诱导细胞在发展过程中不同的细胞命运。在这里，我们展示了一个在OVO准备使用，以解决发展中的不同的蛋白质之间可能的相互作用，由珠E2.5鸡胚。
Abstract
神经管表示在特定的时空模式，在开发过程中的多种蛋白质。这些蛋白质已被证明是对细胞命运的决心，细胞迁移，并形成神经回路至关重要。神经元的诱导和图案涉及骨形态发生蛋白（BMP），刺猬（SHH），成纤维细胞生长因子（FGF），等等。 FGF8的表达模式，尤其是在邻近地区表达BMP4和SHH。这种表达模式与发展的互动，以促进在端脑的图案一致。
在这里，我们提供的视觉示范在其中OVO准备一个可以用来测试在形成前脑Fgfs的影响的方法。珠涂有蛋白质和发展中的神经管提供持续的曝光。因为程序使用小，小心地放在珠，这是微创，并允许被放置在一个单一的神经管几个珠子。此外，该方法可以使胚胎可以在一个比较成熟的的阶段分析，以检测在解剖学和神经图案的变化，持续发展。这一简单实用的协议允许实时成像。它提供了一种手段，使内源性蛋白水平的空间和时间有限的修改。
Protocol
1。取出鸡蛋从孵化器
在E2 - 2.5（〜圣17 HH），去掉鸡蛋和相应准备。他们可工作立即或几个小时的孵化器。鸡蛋可以安全地放置在室温下了一个多小时。鸡蛋可以留出操作的持续时间。有时，这些都需要一个小时或更长时间。
注 ：他们在室温下坐的时间越长，不太可能，他们要生存。
2。印度墨水的制备
- 准备新鲜的解决方案的4％，印度油墨在无菌PBS。
- 3毫升注射器填充解决方案。
- 放置了27计，半英寸的注射器针头。
- 使用对止血，弯曲到90 °角针。
3。打开墨汁的鸡蛋和注射
- 使用一对镊子，剥离的录像带，并在打开的窗口，确保蛋的背面使用的磁带背面。
- 指南在直角针，直到它位于下方的胚胎。配售项下的浮动盘针，确保墨水，这是胚胎毒性，不会直接接触。
- 您只需注入足够的墨水来创造一个舒适的反差。这通常是小于¼毫升。
4。开放性神经管
- 一双细清扫剪刀和削减位于顶部的薄膜，有时甚至左右，胚胎。
- 就拿了一双55钳或钨探针，从后到前的开放性神经管。确保开放是大到足以放入珠。
注 ：根据不同的年龄，罚款钨探针可以用来做同样的事情。
5。检索涂肝素压克力珠
- 使用一对55钳，找到解决方案中的一个完整的珠子。让珠附加给小费，慢慢接近的镊子。
- 从溶液中取出磁珠和鸡蛋的顶部。
- 一旦珠是其解决方案，它不太可能会脱落，直到它被放置在白蛋白。
6。放置珠
- 一旦珠一直放在目标区域的顶部，使用钨探针，以指导对前脑或固定在后脑。
- 添加几滴使用的PBS 10μL移液器。
7。关闭鸡蛋
- 使用的磁带的薄薄的一片关闭窗口关闭鸡蛋。
- 根据预备协议的鸡蛋，在可用 http://jove.com/index/Details.stp?ID=306的密封。
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Discussion
根据您要使用的蛋白质，有不同的协议，关于如何准备珠。在这些实验中，我们使用肝素丙烯酸珠，但也可用于阿菲 - 凝胶珠。我们发现，肝素丙烯酸珠更容易操纵在水环境中的卵白蛋白。珠蛋白质在5升浸泡在4 ° C过夜控制珠被放置在无菌PBS，直到放置时间。在使用OVO准备的优点是，胚胎仍然活着，和自由发展通常为1。虽然保存在其中的一个外植体的环境，可用于特定变量控制的，活的胚胎允许的对发展模式的蛋白质2-3的影响的准确表示。所有检测，您可以执行一个外植体，可以与胚胎。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
