Summary
Eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren und Proteinen interagieren zu induzieren Zellen auf verschiedene Zell-Schicksal während der Entwicklung zu nehmen. Hier zeigen wir die Verwendung eines in-ovo-Vorbereitung auf mögliche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Proteinen in der Entwicklung, indem sie Perlen auf E2.5 Hühnerembryonen Adresse.
Abstract
Das Neuralrohr drückt viele Proteine in bestimmten raumzeitlichen Muster während der Entwicklung. Diese Proteine haben gezeigt, dass entscheidend sein für die Zell-Schicksal Bestimmung, Zellwanderung, Bildung von neuronalen Schaltkreisen. Neuronale Induktion und Musterbildung beteiligt knochenmorphogenetisches Protein (BMP), Sonic Hedgehog (SHH), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), unter anderem. Insbesondere ist das Expressionsmuster von Fgf8 in unmittelbarer Nähe zu Regionen zum Ausdruck BMP4 und SHH. Dieser Ausdruck Muster steht im Einklang mit Entwicklungsstörungen Interaktionen, die Strukturierung erleichtern im Telencephalon.
Hier bieten wir eine bildliche Darstellung eines Verfahrens, in dem ein in-ovo-Herstellung verwendet werden, um die Auswirkungen von FGFs bei der Bildung des Vorderhirns getestet werden können. Beads sind mit Protein beschichtet und in den Entwicklungsländern Neuralrohr Gegen dauerhafte bieten. Da das Verfahren verwendet kleine, sorgfältig platzierten Perlen, ist es minimal-invasiv und erlaubt mehrere Perlen in einer einzigen Neuralrohr platziert werden. Darüber hinaus erlaubt das Verfahren für die weitere Entwicklung, so dass Embryonen in einem reiferen Stadium untersucht werden kann, um Veränderungen in der Anatomie und in neuronalen Mustern zu erkennen. Diese einfache, aber nützliche Protokoll ermöglicht Echtzeit-Bildgebung. Es bietet die Möglichkeit, räumlich und zeitlich begrenzten Änderungen an endogene Protein-Ebene zu machen.
Protocol
1. Entfernen Sie Eier aus dem Inkubator
Bei E2-2.5 (~ St. 17 HH), entfernen Sie die Eier und bereiten sie entsprechend. Sie können sofort oder arbeitete wieder in den Inkubator für ein paar Stunden. Die Eier können bei Raumtemperatur vorgelegt sicher über eine Stunde. Eier können draußen bleiben für die Dauer der Manipulationen. Manchmal sind diese kann eine Stunde oder mehr.
Hinweis: Je länger sie sitzen bei Raumtemperatur, desto weniger wahrscheinlich werden sie überleben.
2. Vorbereitung der Tusche
- Bereiten Sie eine frische Lösung von 4% Tusche in sterile PBS.
- Füllen Sie ein 3-ml-Spritze mit der Lösung.
- Legen Sie eine 27-Gauge-, ½ Zoll-Nadel auf die Spritze.
- Mit einem Paar Hämostatika, biegen Sie die Nadel in einem 90 ° Winkel.
3. Das Öffnen der Eier und Injektion von Tusche
- Mit einer Pinzette, schälen Sie das Band ab und öffnen Sie das Fenster, denn es sicherte, indem Sie die Rückseite des Bandes auf der Rückseite des Eies.
- Guide in den abgewinkelten Nadel, bis es gerade liegt unterhalb des Embryos. Platzierung der Nadel unter die schwebende Scheibe sicher, dass die Tinte, die giftig für den Embryo ist, wird nicht in direkten Kontakt kommen.
- Sie müssen sich nur genügend Tinte spritzen, um einen angenehmen Kontrast zu schaffen. Dieser ist in der Regel weniger als ¼ mL.
4. Eröffnung des Neuralrohrs
- Nehmen Sie ein Paar von feinen Sezierung Schere und schnitt die dünne Membran, die auf der Oberseite liegt, oder manchmal herum, den Embryo.
- Nehmen Sie ein Paar von 55 Zange oder einer Wolfram-Sonde und öffnen Sie das Neuralrohr von posterior nach anterior. Achten Sie darauf, die Öffnung ist groß genug, um eine Perle darin Platz.
Hinweis: Je nach Alter, ein feines Wolfram Sonde kann verwendet werden, um die gleiche Sache zu tun.
5. Abrufen einer beschichteten Heparin-Acryl-Perlen
- Mit einem Paar von 55 Pinzetten, finden eine intakte Perle in der Lösung. Lassen Sie die Raupe hängt sich an die Spitze, langsam schließen Sie die Zange.
- Entfernen Sie die Perle aus der Lösung und bringen Sie es oben auf dem Ei.
- Sobald die Kügelchen aus seiner Lösung, wird es wahrscheinlich nicht aus, bis es in das Albumin gelegt zu kommen.
6. Platzierung der Perle
- Sobald die Raupe hat auf der Oberseite des Zielbereichs gelegt, mit einem Wolfram-Sonde, um es in Richtung Vorderhirn Anleitung oder fix it in der Hinterhirn.
- Fügen Sie ein paar Tropfen PBS mit einem 10 ul Pipette.
7. Closing the egg
- Schließen Sie das Ei mit dem dünnen Stück Klebeband, um das Fenster zu schließen.
- Seal das Ei nach dem prepping Protokoll, verfügbar unter http://jove.com/index/Details.stp?ID=306 .
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Discussion
Je nach Protein, das Sie verwenden möchten, gibt es verschiedene Protokolle, wie die Perlen vorzubereiten. In diesen Experimenten verwenden wir Heparin-Acryl-Perlen, aber Affi-Gel-Kügelchen können ebenfalls verwendet werden. Wir haben festgestellt, dass die Heparin-Acrylperlen einfacher, in der wässrigen Umgebung des Eieralbumin zu manipulieren sind. Beads sind in 5 l Protein über Nacht bei 4 ° C eingeweicht Control-Kügelchen werden in sterile PBS bis zum Zeitpunkt der Platzierung gelegt. Der Vorteil in der Verwendung eines in-ovo-Zubereitung ist, dass der Embryo noch am Leben ist und frei, in der Regel 1 zu entwickeln. Obwohl die Umgebung, in der ein Explantat gehalten wird für bestimmte Variablen gesteuert werden kann, ermöglicht die Live-Embryo für eine genaue Darstellung der Auswirkungen eines Proteins auf Entwicklungsmuster 2-3. Alle Tests, die Sie auf einem Explantat ausführen können, können Sie mit einem Embryo.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Fertilized, E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| Incubator | Profi-I | Lyon | ||
| India Ink | Tool | Higgins | Prepare a 4% solution in sterile PBS. | |
| Sterile PBS | Alternatively, an antibody cocktail can be used | |||
| 1ml syringe | ||||
| 27G 1/2 needles | Tool | BD Biosciences | 305109 | Angled at 90 degrees |
| Forceps | Tool | World Precision Instruments, Inc. | size 55 | |
| Hemostats | ||||
| Dissection scissors | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | vannas, 8.5cm |
| Parafilm tape | to seal eggs | |||
| Tungsten Probe | Tool | Electron Microscopy Sciences | 62091 | Tool #24. Handle optional. |
References
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
