Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

IgY Технология: Добыча Куриный Антитела из яичного желтка на полиэтиленгликоля (ПЭГ) осадков

doi: 10.3791/3084 Published: May 1, 2011

Summary

Этот протокол описывает, в частности, добыча от общего числа IgY из яичного желтка с помощью полиэтилена осадков гликоль и дает общую информацию о IgY технологии.

Abstract

Куры могут пройти иммунизацию с помощью им вакцинации (мышцы грудной, влево и вправо, объемом впрыска 0,5-1,0 мл) или с помощью генно-Gun-плазмиды иммунизации. В зависимости от иммуногенность антигена, высокие титры антител (до 1:100000 - 1:1000000) может быть достигнуто только после одного или 3 - 4 прививки импульс. Как правило, курица откладывает яйца непрерывно в течение около 72 недель, после укладки уменьшается мощность. Этот протокол описывает добычу от общего числа IgY из яичного желтка с помощью осаждения процедуры (PEG. Полсон и соавт. 1980). Метод включает в себя два важных шагов. Первое удаление липидов и второй осадков от общего числа IgY из супернатанта шагу. После диализа против буфера (как правило, PBS) IgY-экстракт может храниться при температуре -20 ° С в течение более года. Чистотой экстракта составляет около 80%, общая IgY на яйцо составляет от 40-80 мг, в зависимости от возраста несушки. Общая IgY содержание увеличивается с возрастом курица из примерно 40 мг / яйцо до 80 мг / яйцо (в отношении PEG осадков). Яйценоскость на курицу в год составляет около 325 яиц. Это означает, что общий потенциал урожая от 20 г общего IgY / год на основе среднего содержания IgY 60 мг общего IgY / яйцо (см. Таблицу 1).

Protocol

1. Протокол - IgY-экстракция с помощью ПЭГ-осадков

Рис. 1 приводится схема IgY-экстракции (см. таблицу 2). Протокол был впервые описан в Полсон и соавт. 1980 год.
Все шаги должны быть выполнены с использованием латексных перчаток.

  1. Яичной скорлупы тщательно трещины и желток переносится на "желток ложкой", чтобы удалить как можно больше яичного белка, насколько возможно.
  2. Желток переносится на фильтровальную бумагу и проката, чтобы удалить остатки яичного белка, то кожа желток режется с ланцетом или аналогичного инструмента (пипетки). Желток выливают в 50 мл трубки и яйца объем зарегистрированных (V1).
  3. Два раза объем яичный желток ФСБ смешивают с желтком (ΣV1 + V2), после этого 3,5% ПЭГ 6000 (в граммах, измельченный) от общего объема добавляется и перемешивают, а затем на 10 минут катался по прокатке смесителя. Это шаг отделяет процедуры извлечения суспензии в два этапа. Одна фаза состоит из "твердых желток и жировые вещества" (в оригинале котировки Полсон и соавт. 1980) и водянистые фазы, содержащей IgY и других белков.
  4. Трубы центрифугировали при 4 ° С в течение 20 мин (10 000 оборотов в минуту по 13 000 мкг, Heraeus Multifuge 3SR +, фиксированный угол ротора). Супернатант (V3) заливается через складчатый фильтр и переведен в новую трубу.
  5. 8,5% ПЭГ 6000 в граммах (рассчитанный в соответствии с новым объема) будут добавлены в трубке, встряхивали и проката на постоянной смесителя, как в шаге 3.
  6. Повторите шаг 4 с той разницей, что супернатант отбрасывается.
  7. Осадок тщательно растворяют в 1 мл PBS с помощью палки стекла и vortexer. PBS будет добавлен в конечном объеме 10 мл (V4). Раствор смешивают с 12% ПЭГ 6000 (м / о, 1,2 г) и обрабатывают, как в шаге 3 (вихрь, прокат смесителя).
  8. Повторите шаг 6 и растворить гранулы тщательно в 800 мкл PBS (стеклянной палочкой и вихревые). Подождите, пока пузырьки воздуха исчезают, а затем передать (пипетки) экстракт диализа капсулы. Промойте трубку с 400 мкл PBS и добавить объем диализа устройство (версии 5). (Для приготовления диализных устройств и мембран см. приложение).
  9. Экстракт диализу в течение ночи в 0,1% физиологического раствора (1600 мл) и осторожно перемешивают с помощью магнитной мешалки. Следующим утром, солевые заменяется PBS и диализ в течение еще трех часов.
  10. После этого IgY-экстракт вытащил из диализа капсулу пипетки и переданы в 2 мл труб. Конечный объем составляет около 2 мл (V6).
  11. Содержание белка (мг / мл) образцов измеряется фотометрически при 280 нм (1:50 разбавляют PBS) и рассчитывается в соответствии с Ламберта-Бера с коэффициента экстинкции 1,33 для IgY (см. рис. 2), рис . 4 показывает качество подготовки (чистота и восстановление около 80%).
  12. Желательно хранить образцы в аликвоты при -20 ° C (не замораживать образцы при -70 ° С).
  13. Качество последние приготовления анализируется простой SDS-PAGE, как описано в протоколе Юпитера http:/www.jove.com/details.php?id=1916

2. Приложение-перед использованием диализа пакет должен быть подготовлен в следующем образом в соответствии с рекомендациями производителя:

  1. 20 пакетиков диализа разрезают на куски по 30 см и приводится в 2000 Стакан стеклянный мл.
  2. 1750 мл 5 мМ ЭДТА-раствору добавляют.
  3. Стеклянная воронка находится над мешки для того, чтобы сумки покрыты раствора ЭДТА. Раствор нагревают и кипятят в течение 5 мин (плитка). Раствор сливают и сумки промывают три раза дистиллированной водой.
  4. Еще раз 1750 мл ЭДТА-раствору добавляют, кипятят 5 мин и промывают три раза дистиллированной водой как указано выше.
  5. Наконец диализа мешки кипятят 10 мин в дистиллированной воде и хранили при 4 ° C. Выньте диализа мешки с помощью пинцета стерилизовать.

3. Представитель результаты

Рисунок 1
Рисунок 1. Принципиальная схема IgY-экстракция с помощью полиэтиленгликоля осадков в соответствии с первоначальным описанием Полсон и соавт. 1980 год. Для просмотра больших изображений, нажмите здесь.

Рисунок 2
Рисунок 2. Разработка полного IgY в яичном желтке иммунизированных кур в зависимости от возраста. Учитывая это еженедельное среднее общее IgY / яйцо и SD (п = 4 кур-несушек). Из [Паули и соавт. 2009]).

Рисунок 3
Рисунок 3. Layiнг потенциала в области мониторинга четырех кур, иммунизированных различными антигенами. Стрелки указывают дату иммунизации (из [Паули и соавт. 2009]). Для просмотра больших изображений, нажмите здесь.

Рисунок 4
Рисунок 4. Полиакриламидном-Gelelectrophoresis индивидуальной подготовки IgY из разных яиц в восстановительных условиях
Полоса 1 - маркер молекулярного веса, переулок 2 - IgY стандарта, Lane 3-5 - различные образцы IgY приготовленного, как описано в протоколе. Эти последние приготовления в соответствии с шагом 10 из протокола. HC - тяжелые цепи, LC - светло chaines,? - Незначительные примеси соответствующие молекулярным весом около 35 кДа (вероятно, С-концевой фрагмент предшественника вителлогенина II, [Klimentzou и др., 2006.]).

  Куриные 21 (антиген) Куриные 22 (антиген) Куриные 19 (антиген В) Куриные 23 (антиген С)
Яйцо числа (всего IgY) 1, 2-летний период 625 (38 г) 626 (38 г) 545 (33 г) 608 (37 г)
Яйцо числа (всего МГГ), первый год 345 (20 г) 304 (16 г) 326 (18 г) 308 (17 г)
Яйцо числа (всего МГГ), второй год 280 (18 г) 322 (21 г) 219 (15 г) 300 (20 г)
% От макс. возможное число яйцо (первый год) 2 106 93 100 95
% От макс. возможное число яиц (второй год) 86 99 67 92
количество обработанных яиц 565 620 283 401

1 Общая сумма IgY рассчитывается путем умножения количества яиц средним значением 60 мг белка в яйце в соответствии с данными на рисунке 2.

2 макс. возможное число яйца в год составляет 325 в соответствии с информацией селекционера.

Таблица 1. Два года статистика яйцо яйценоскость кур, иммунизированных различными антигенами. Укладка мощности в процентах не более четырех кур после иммунизации различными антигенами, а также IgY-исхода в течение двух лет (см. также рис. 3), [Паули и соавт. 2009]).

Яйцо Nr. Курица Nr. Укладка дате V1 [мл] желток V2 [мл] PBS 1. PEG предшествующий. [Г] Том [мл] после 2. PEG предшествующий. [Г] Гранула 3. PEG предшествующий. [Г] Гранула Том [мл] Общий белок мг / мл Исправлено общего белка мг / мл
2xV1 ΣV1 + V2 3,5% [м / о] ΣV1 + V2 предшествующий., centrif. и фильтрации V3 8,5% [м / о] V3 растворяется в мл PBS V4 12% [/ об] V4 Растворенный в мл PBS V5 После диализа против PBS V6 A280/ml A280/ml: 1.33
1 H293 / 22.10. 15 30 45 1,58 31 2,63 10 1,2 1,2 1,7 35,0 26,3
2 H293 / 23.10. 13 26 39 1,37 25 2,12 10 1,2 1,2 1,7 28,8 21,6

Таблица 2. Образцовый протокол PEG осадков

Discussion

Выбор подходящего метода очистки IgY зависит от масштаба очистки (лабораторных или промышленных), эффективность затрат, технологии (лабораторное оборудование), и воздействие на окружающую среду (управление отходами). Различные методы добычи IgY были подробно рассмотрен Де Meulenaer & Huyghebaert (2001, для обзора см. также Шаде и соавт. 2005). В целом, эти методы могут быть разделены на три основные группы:

  1. Осадки методами: с участием аммония или сульфата натрия, полиэтиленгликоль (ПЭГ), каприловой кислоты и caragenean.
  2. Хроматографические методы: аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, гидрофобной хроматографии взаимодействия, thiophylic хроматографии взаимодействия, и гель-фильтрации хроматографии.
  3. Ультрафильтрации.

Чистота IgY препарата может быть увеличена на комбинации методов, например, ПЭГ осадков могут быть объединены с аффинной хроматографии. В некоторых случаях, в зависимости от конечного применения, водный экстракт IgY достаточно для достижения хороших результатов (Акита и Накаи 1993). По нашему опыту, IgY-образец получаем с помощью ПЭГ-осадков работал очень хорошо в много различных иммунологических анализов. За счет стандартизации PEG-метода осаждения один технический помощник способен обрабатывать около 84 яиц в неделю, что соответствует сумме от общего числа IgY от 4 до 7 г в неделю. Простой расчет: несушки является иммунизированных антигеном. Через несколько прививки повышения курицы производит специфические антитела (АТ) с титр 1:50000 в течение периода в 30 дней. 30 яиц х 2 мл IgY экстракт (см. протокол и рис. 3) соответствует 60 мл общего IgY, который, в свою очередь, соответствует Ab-разведении 3000 л (мощностью ведро 10 л), это означает, что с 3000 л решения Ab 300 ведра могут быть заполнены. Таким образом, с учетом такого огромного количества Ab-это не проблема для хранения Аб-пул постоянное качество и специфику. Этот метод уменьшает заряд / много изменчивости в противном случае наблюдается в polyspecific Ab.

Несмотря на аспекте количества, IgY Ab еще больше преимуществ по сравнению с IgG млекопитающих: Нет активации системы комплемента млекопитающих, нет перекрестной реактивности с HAMA (человеческих анти мышиного антитела), ревматоидный фактор или человеческие группы крови антигенов (отсутствие heteroagglutinins).

Выдающимися преимуществами IgY-Ab является так называемый филогенетический расстояния. Филогенетические расстояние причина часто описывают различия между особенностями Ab млекопитающих и куры, даже тогда, когда одинаково прививки. В дополнение к различиям между млекопитающих и птичьего иммунной системы сами, различия в филогенетического развития в этих двух классов животного вносит свой вклад в различные особенности Ab. Некоторые авторы сообщают, что куры часто производят Abs против филогенетически хорошо сохранились и млекопитающих, белки или пептиды более эффективно, чем кролики (см. обзор Шаде и др. a. 2005). Как следствие, сохраняется антиген может оставаться "в масках", чтобы кролик иммунной системы, и тем самым вызывают только слабые или "тихая" ответ. Кроме того, если кур и кроликов, иммунизированных млекопитающих же антиген, очень часто куры ответить Ab-специфичность, что редко могут быть достигнуты в кроликов. Также аспект животных очень важно, поскольку Ab являются неинвазивным извлечены из яичного желтка. В сочетании с Джином-Gun (плазмиды) иммунизации IgY производства полностью неинвазивным (Витковский и соавт. 2009).

В заключение производства Ab у кур и IgY-экстракция с помощью ПЭГ-осадки очень рентабельным и приводит к весьма специфический Ab со стабильной титры до 1:1000000. В связи с филогенетической расстояние между Aves и Mammalia, курица в состоянии производить конкретные Ab против хорошо сохранились и млекопитающих антигенов, в отличие от, например, кроликов. Огромный объем Ab получен IgY-технология открывает двери и для использования IgY-Ab в человеческой и ветеринарной медицине для терапевтических / профилактических целях.

Disclosures

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Landesamt меха Gesundheit унд Soziales Берлине (H 0069/03).

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом немецкого Федерального министерства образования и исследований (проект BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, и ltraschnelle D etektion унд я dentifizierung фон bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Мы благодарим В. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Берлине, Institut für Pharmakologie) за отличную техническую помощь.

Materials

  1. Dialyse Bag Visking, Type 27/32, cut off -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
  2. Falcon tubes Blue Max, 50 ml Polypropylene Conical Tube, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes NY, USA
  3. Folded Filter MN 615 ¼, 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany Heraeus
  4. Magnetic stirrer, Variomag Mono, H+P Labortechnik AG, Oberschleißheim, Germany
  5. Micro-Dialyse-Capsule 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
  6. Multifuge 3SR+, Thermo Scientific, Langenselbold, Germany
  7. Photometer UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Germany
  8. Polyethylene Glycol 6000, Rotipuran Ph. Eur., Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
  9. Premixed PBS-Buffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany
  10. Roller Mixer SRT2, Stuart, Staffordshire, UK
  11. Vibrofix VF2, Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen i.Br., Germany
  12. Yolk spoon, Fackelmann (houshold effects), Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akita, E. M., Nakai, S. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).
  2. De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review. Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).
  3. Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27, 183-193 (2006).
  4. Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period. Poultry Science. 88, 281-290 (2009).
  5. Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens. Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).
  6. Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology. Springer. Berlin. (2001).
  7. Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).
  8. Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies. J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).
IgY Технология: Добыча Куриный Антитела из яичного желтка на полиэтиленгликоля (ПЭГ) осадков
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pauly, D., Chacana, P. A., Calzado, E. G., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation. J. Vis. Exp. (51), e3084, doi:10.3791/3084 (2011).More

Pauly, D., Chacana, P. A., Calzado, E. G., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation. J. Vis. Exp. (51), e3084, doi:10.3791/3084 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter