Dieses Protokoll beschreibt insbesondere die Extraktion der Gesamt-IgY aus Eigelb mittels Polyethylenglykol Niederschlag und gibt allgemeine Informationen über IgY-Technologie.
Hens kann durch im Impfung (Musculus pectoralis, links und rechts, Injektionsvolumen 0,5-1,0 ml) oder mit Hilfe von Gene-Gun-Plasmid-Immunisierung immunisiert werden. Abhängig von der Immunogenität des Antigens, hohe Antikörper-Titer (bis 1:100.000 – 1:1.000.000) kann nach nur einem oder 3 erreicht werden – 4 steigern Impfungen. Normalerweise legt eine Henne Eier kontinuierlich für etwa 72 Wochen, danach wird die Legeleistung sinkt. Dieses Protokoll beschreibt die Extraktion von insgesamt IgY aus Eigelb durch ein Niederschlag Verfahren (PEG. Polson et al. 1980). Das Verfahren beinhaltet zwei wichtige Schritte. Die erste ist die Entfernung von Lipiden und das zweite ist die Fällung von insgesamt IgY aus dem Überstand von step one. Nach der Dialyse gegen einen Puffer (in der Regel PBS) der IgY-Extrakt kann bei -20 ° C für mehr als ein Jahr gelagert werden. Die Reinheit des Extraktes beträgt rund 80%, variiert die Summe IgY pro Ei 40 bis 80 mg, abhängig vom Alter der Legehennen. Der gesamte Inhalt IgY steigt mit dem Alter der Henne von rund 40 mg / Ei bis zu 80 mg / Ei (über PEG-Fällung). Die Legeleistung einer Henne pro Jahr rund 325 Eier. Das bedeutet insgesamt möglichen Ernte von 20 g insgesamt IgY / Jahr bezogen auf eine mittlere IgY-Gehalt von 60 mg insgesamt IgY / Ei (siehe Tabelle 1).
Die Wahl eines geeigneten IgY Reinigungsverfahren ist nach Skala der Reinigung (Labor oder Industrie), Wirtschaftlichkeit, Technik (Laborausstattung) und Auswirkungen auf die Umwelt (Abfallwirtschaft) beeinflusst. Verschiedene IgY Extraktionsmethoden wurden im Detail durch De Meulenaer & Huyghebaert (2001, zur Überprüfung siehe auch Schade et al. 2005) überprüft. Im Allgemeinen können diese Methoden in drei Hauptgruppen eingeteilt werden:
Die Reinheit eines IgY Vorbereitung kann durch eine Kombination von Methoden erhöht werden, z. B. PEG-Fällung mit Affinitätschromatographie kombiniert werden. In einigen Fällen, abhängig von der endgültigen Anwendung wird ein wässriger Extrakt der IgY ausreichend, um gute Ergebnisse (Akita & Nakai 1993) zu erreichen. Nach unserer Erfahrung, arbeiteten die IgY-Probe, die wir durch PEG-Fällung erhalten sehr gut in vielen verschiedenen immunologischen Tests. Durch die Standardisierung der PEG-Fällungsverfahren eine technische Assistentin in der Lage, ungefähr 84 Eier pro Woche, was zu einem Betrag von insgesamt IgY zwischen 4 und 7 g pro Woche entspricht Prozess. Eine einfache Rechnung: Eine Legehenne ist mit einem Antigen immunisiert. Nach ein paar steigern Impfungen die Henne produziert spezifische Antikörper (Ab) mit einem Titer von 1:50.000 in einem Zeitraum von 30 Tagen. 30 Eier x 2 ml IgY-Extrakt (siehe Protokoll und Bild. 3) entspricht 60 ml insgesamt IgY, was wiederum entspricht einer Ab-Verdünnung von 3.000 l (die Kapazität einer Schaufel 10 l), die mit 3.000 l bedeutet von Ab Lösung 300 Eimer gefüllt werden kann. Also, im Hinblick auf so große Ab-Menge ist es kein Problem, eine Ab-Pool von konstanter Qualität und Spezifität zu speichern. Diese Technik reduziert die Lade / viel Variabilität sonst in polyspezifischen Ab beobachtet.
Trotz der Aspekt der Quantität haben IgY Ab weitere Vorteile im Vergleich zu Säugetieren IgG: Keine Aktivierung von Säugetier-Komplement-System, keine Kreuzreaktivität mit HAMA (human anti-Maus-Antikörper), Rheumafaktoren oder menschlichen Blutgruppen-Antigene (fehlende heteroagglutinins).
Ein herausragender Vorteil der IgY-Ab ist die sogenannte phylogenetische Distanz. Phylogenetische Distanz ist der Grund für die häufig beschriebenen Unterschiede zwischen den Ab Besonderheiten von Säugetieren und Geflügel, auch wenn identisch immunisiert. Neben den Unterschieden zwischen den Säugetieren und die Vogelgrippe Immunsystem selbst trägt Unterschiede in stammesgeschichtlichen Entwicklung in diesen beiden Tierklassen auf die verschiedenen Ab Besonderheiten. Mehrere Autoren haben berichtet, dass Hühner produzieren häufig Abs gegen phylogenetisch hochkonservierte Säugetieren gewonnenen Proteinen oder Peptiden effizienter als die Kaninchen (für eine Übersicht siehe Schade et a. 2005). Als Folge davon kann eine konservierte Antigen bleiben "maskiert", um das Kaninchen Immunsystem und verursachen so nur einen schwachen oder eine "stille" Antwort. Außerdem, wenn Hühner und Kaninchen mit der gleichen Säugetieren Antigen immunisiert, sehr oft die Hühner mit einem Ab-Spezifität, die nur selten bei Kaninchen erzielt werden können reagieren. Auch der Aspekt des Tierschutzes ist wichtig, da die Ab non-invasiv werden extrahiert aus Eigelb. In Kombination mit Gene-Gun (Plasmid) Immunisierung der IgY-Produktion ist komplett nicht-invasive (Witkowski et al. 2009).
Im Ergebnis ist die Herstellung von Ab in Hennen und die IgY-Extraktion mittels PEG-Fällung sehr kostengünstig und führt zu sehr spezifischen Ab mit stabilen Titer von bis zu 1:1.000.000. Aufgrund der phylogenetischen Abstand zwischen Aves und Mammalia sind Hühner in der Lage, spezifische Ak gegen hochkonservierte Säugetieren Antigene im Gegensatz zu zB Kaninchen zu produzieren. Die außergewöhnliche Höhe der Ab durch IgY-Technologie erhalten die Tür öffnet auch für den Einsatz von IgY-Ab in Human-und Veterinärmedizin zu therapeutischen / prophylaktischen Zwecken.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem deutschen Bundesministerium für Bildung und Forschung gefördert (Projekt BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und ich dentifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Wir danken B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlin, Institut für Pharmakologie) für hervorragende technische Unterstützung.