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Immunology and Infection

IgY प्रौद्योगिकी: चिकन एंटीबॉडी से अंडे की जर्दी के polyethylene glycol द्वारा निकालना वर्षा (खूंटी)

doi: 10.3791/3084 Published: May 1, 2011

Summary

इस प्रोटोकॉल polyethylene glycol वर्षा के माध्यम से अंडे की जर्दी से कुल IgY की विशेष निकासी में वर्णन करता है और IgY प्रौद्योगिकी के बारे में सामान्य जानकारी देता है.

Abstract

मुर्गियाँ im (pectoralis मस्कुलस, बाएँ और दाएँ, इंजेक्शन की मात्रा 0.5-1.0 मिलीलीटर) टीकाकरण के माध्यम से या जीन गन प्रतिरक्षण - प्लाज्मिड के माध्यम से प्रतिरक्षित किया जा सकता है है. प्रतिजन के प्रतिरक्षाजनकता पर निर्भर करता है, उच्च एंटीबॉडी titres (अप करने के लिए 1:100,000 - 1:1,000,000) केवल एक या 3 के बाद हासिल किया जा सकता है - 4 बढ़ावा देने के टीकाकरण. आम तौर पर, एक मुर्गी अंडे लगातार लगभग 72 हफ्तों के लिए, देता है उसके बाद बिछाने की क्षमता घट जाती है. इस प्रोटोकॉल एक तेज़ी प्रक्रिया के माध्यम से (PEG. Polson एट अल. १९८०) द्वारा अंडे की जर्दी से कुल IgY की निकासी का वर्णन करता है . विधि के दो महत्वपूर्ण कदम शामिल है. पहले एक lipids के हटाने है और दूसरा एक कदम की सतह पर तैरनेवाला से कुल IgY की तेज़ी है. एक साल से भी अधिक के लिए एक बफर (सामान्य पीबीएस) के खिलाफ डायलिसिस के बाद IgY निकालने -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. निकालने की शुद्धता 80% के आसपास है, अंडे प्रति कुल IgY 40-80 मिलीग्राम से बदलता है, बिछाने मुर्गी की उम्र पर निर्भर है. लगभग 40 मिलीग्राम / 80 मिलीग्राम / अंडा (खूंटी तेज़ी से संबंधित) अंडे से कुल IgY मुर्गी के उम्र के साथ सामग्री बढ़ जाती है. प्रति वर्ष एक मुर्गी की बिछाने की क्षमता 325 अंडे के आसपास है. यह कुल 20 ग्राम कुल IgY / 60 मिलीग्राम कुल IgY / अंडा (देखें तालिका 1) के एक मतलब IgY सामग्री के आधार पर वर्ष के एक संभावित फसल का मतलब है.

Protocol

1. प्रोटोकॉल - खूंटी - वर्षण की माध्यम से IgY-निष्कर्षण

चित्र 1 IgY-निष्कर्षण प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध आरेख (तालिका 2 देखें) देता है. प्रोटोकॉल पहले Polson एट अल में वर्णित किया गया था. 1980.
सभी चरणों लाटेकस दस्ताने का उपयोग किया जाना चाहिए.

  1. eggshell ध्यान और टूट जर्दी एक "जर्दी चम्मच" के लिए स्थानांतरित कर रहा है क्रम में बहुत संभव के रूप में सफेद अंडे के रूप में निकालना है.
  2. जर्दी एक फिल्टर पेपर के लिए स्थानांतरित किया है और शेष अंडे का सफेद हटाने लुढ़का, तो जर्दी त्वचा एक नुकीला या ऐसे ही एक साधन (विंदुक टिप) के साथ कट जाता है. जर्दी एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में डाल दिया है और अंडे की मात्रा (v1) पंजीकृत है.
  3. पीबीएस के अंडे की जर्दी मात्रा में दो बार की जर्दी (ΣV1 V2 +), उसके बाद 3.5% कुल मात्रा का खूंटी छह हज़ार (ग्राम में, चूर्णित) के साथ मिश्रित है जोड़ा है और vortexed, उसके बाद 10 मिनट एक रोलिंग मिक्सर पर रोलिंग द्वारा. निष्कर्षण प्रक्रिया का यह कदम दो चरणों में निलंबन अलग करती है. एक चरण "की जर्दी ठोस और वसायुक्त पदार्थ" (Polson एट अल के मूल उद्धरण 1980) और एक पानी IgY और अन्य प्रोटीन युक्त चरण के होते हैं.
  4. ट्यूब 4 पर centrifuged कर रहे हैं ° 20 मिनट (10,000 rpm XG 13,000, Heraeus Multifuge 3SR + निर्धारित कोण रोटर के अनुसार) के लिए सी. सतह पर तैरनेवाला (V3) एक जोड़ फिल्टर के माध्यम से डाला है और एक नया ट्यूब को हस्तांतरित.
  5. खूंटी के 6000 ग्राम (नई मात्रा के अनुसार गणना) में 8.5% ट्यूब को जोड़ रहे हैं, vortexed और चरण 3 में एक रोलिंग मिक्सर पर लुढ़का.
  6. अंतर यह है कि सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया है के साथ चरण 4 दोहराएँ.
  7. गोली ध्यान से एक गिलास छड़ी और vortexer के माध्यम से 1 मिलीलीटर पीबीएस में भंग. पीबीएस 10 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा (V4) जोड़ा जाता है. समाधान के 12% खूंटी 6000 (w / ध्, 1.2 ग्राम) के साथ मिलाया जाता है और चरण 3 (भंवर, रोलिंग मिश्रक) के रूप में इलाज किया.
  8. दोहराएँ चरण 6 और 800 μl पीबीएस में ध्यान से गोली भंग (गिलास छड़ी और भंवर). हवाई बुलबुले के लिए रुको के लिए गायब हो और फिर (विंदुक) एक डायलिसिस कैप्सूल निकालने हस्तांतरण. 400 μl पीबीएस के साथ ट्यूब कुल्ला और डायलिसिस डिवाइस (V5) के लिए मात्रा जोड़ने. (डायलिसिस उपकरणों और झिल्ली की तैयारी के लिए परिशिष्ट देखें.)
  9. निकालने रात से अधिक 0.1% खारा (1600 मिलीग्राम) में dialysed है और धीरे से एक चुंबकीय उत्तेजक के माध्यम से उभारा. अगली सुबह, खारा PBS द्वारा जगह है और एक और तीन घंटे के लिए dialysed.
  10. इसके बाद IgY-निकालने डायलिसिस कैप्सूल से विंदुक द्वारा खींचा जाता है और 2ml ट्यूबों को हस्तांतरित. अंतिम मात्रा 2 मिलीलीटर (V6) के आसपास है.
  11. चित्र नमूने के प्रोटीन सामग्री (मिलीग्राम / एमएल) photometrically 280 एनएम (01:50 पीबीएस के साथ पतला) में मापा जाता है और 1.33 की एक IgY के लिए विलुप्त होने के गुणांक के साथ लैम्बर्ट - बीयर कानून के अनुसार गणना की है (चित्र देखें 2.), . 4 तैयारी की गुणवत्ता (पवित्रता और वसूली लगभग 80% हैं) से पता चलता है.
  12. यह aliquots में -20 में नमूने की दुकान के लिए सलाह दी जाती है डिग्री सेल्सियस (नमूने -70 ° सी में स्थिर नहीं करते).
  13. सरल एसडीएस PAGE द्वारा अंतिम तैयारी की गुणवत्ता का विश्लेषण किया जाता है के रूप में जौव प्रोटोकॉल में वर्णित http:/www.jove.com/details.php?id=1916

2. परिशिष्ट से पहले का उपयोग डायलिसिस बैग निर्माता की सिफारिशों के अनुसार निम्नलिखित तरीके से तैयार किया जाना चाहिए:

  1. 20 डायलिसिस बैग 30 सेमी के टुकड़ों में काट रहे हैं और एक 2000 मिलीलीटर कांच बीकर में दी गई है.
  2. 5 मिमी EDTA समाधान के 1750 मिलीलीटर जोड़ रहे हैं.
  3. एक गिलास कीप बैग के ऊपर रखा गया है सुनिश्चित करें कि बैग EDTA समाधान द्वारा कवर कर रहे हैं. समाधान गर्म है और 5 मिनट (गर्म थाली) के लिए उबला हुआ. समाधान decanted है और बैग आसुत जल के साथ तीन बार धो रहे हैं.
  4. एक बार फिर +१,७५० EDTA समाधान मिलीलीटर जोड़ा है, 5 मिनट के लिए उबला हुआ और आसुत जल के साथ ऊपर के रूप में तीन बार धोया.
  5. अंत में डायलिसिस बैग आसुत पानी में 10 मिनट के लिए उबला हुआ हैं और 4 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस निष्फल चिमटी के माध्यम से डायलिसिस बैग ले लो.

3. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1 polyethylene glycol Polson एट अल के मूल विवरण के अनुसार वर्षा के माध्यम से IgY निष्कर्षण के योजनाबद्ध आरेख. 1980. बड़ी छवि को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2 कुल IgY की उम्र के निर्भरता में प्रतिरक्षित मुर्गियाँ अंडे की जर्दी में विकास. कुल IgY / अंडा और एसडी (n = 4 बिछाने मुर्गियाँ) के साप्ताहिक मतलब देखते हुए. [Pauly एट अल 2009] से).

चित्रा 3
चित्रा 3 Layi.चार विभिन्न प्रतिजनों के साथ प्रतिरक्षित मुर्गियाँ एनजी क्षमता की निगरानी. तीर प्रतिरक्षण तिथि ([Pauly एट अल 2009] से) से संकेत मिलता है एक बड़ा छवि क्लिक करें यहाँ देखने.

चित्रा 4
चित्रा 4 शर्तों को कम करने के तहत विभिन्न अंडे से व्यक्तिगत IgY तैयारी के polyacrylamide - Gelelectrophoresis .
1 लेन - आण्विक वजन मार्कर, 2 लेन - IgY मानक, 3-5 लेन - अलग IgY नमूने तैयार के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित है. अंतिम प्रोटोकॉल के चरण से 10 के अनुसार तैयारी कर रहे हैं. कोर्ट - भारी जंजीरों, नियंत्रण रेखा - प्रकाश chaines,? - मामूली 35 केडीए (शायद सी - टर्मिनल vitellogenin द्वितीय अग्रदूत के टुकड़ा [. Klimentzou एट अल, 2006]) के आसपास आणविक वजन करने के लिए इसी दोष .

  21 चिकन (एंटीजन ए) 22 चिकन (एंटीजन ए) 19 चिकन (एंटीजन बी) 23 चिकन (एंटीजन सी)
अंडे (कुल IgY) संख्या 1, 2 साल की अवधि 625 (38 छ) 626 (38 छ) 545 (33 छ) 608 (37 छ)
अंडे संख्या (कुल IgY), प्रथम वर्ष 345 (20 ग्राम) 304 (16 छ) 326 (18 छ) 308 (17 छ)
अंडे संख्या (कुल IgY), दूसरे वर्ष 280 (18 छ) 322 (21 छ) 219 (15 छ) 300 (20 ग्राम)
% की अधिकतम. संभव अंडे (प्रथम वर्ष) संख्या 2 106 93 100 95
% की अधिकतम. संभव अंडे संख्या (दूसरे वर्ष) 86 99 67 92
संसाधित अंडे की संख्या 565 620 283 401

1 कुल IgY की राशि अंडा प्रति 60 मिलीग्राम चित्रा 2 के डेटा के अनुसार प्रोटीन का एक मतलब मूल्य से अंडे की संख्या गुणा करके गणना की है.

2 अधिकतम. प्रति वर्ष संभव अंडे संख्या ब्रीडर की एक जानकारी के अनुसार 325 है.

तालिका 1 विभिन्न प्रतिजनों के साथ प्रतिरक्षित मुर्गियों के अंडा बिछाने क्षमता के दो साल के आंकड़े . प्रतिशत में चार मुर्गियाँ की अधिकतम क्षमता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दो वर्षों के दौरान अलग IgY - परिणाम प्रतिजनों के साथ प्रतिरक्षण के बाद (चित्र भी देख 3.) बिछाने, [Pauly एट अल 2009.] ).

अंडा Nr. मुर्गी Nr. तिथि लेटो V1 [मिलीलीटर] जर्दी V2 [मिलीलीटर] पीबीएस 1. खूंटी prec. [छ] वॉल्यूम [मिलीलीटर] के बाद 2. खूंटी prec. [छ] गोली 3. खूंटी prec. [छ] गोली वॉल्यूम [मिलीलीटर] कुल प्रोटीन मिलीग्राम / एमएल सही कुल प्रोटीन मिलीग्राम / एमएल
ΣV1 2xV1 + V2 3,5% [w / ध्] ΣV1 + V2 prec, centrif. और निस्पंदन V3 8,5% [w / v] V3 मिलीलीटर V4 पीबीएस में भंग 12% [w / ध्] V4 मिलीलीटर पीबीएस V5 में भंग पीबीएस V6 के खिलाफ डायलिसिस के बाद A280/ml A280/ml: 1.33
1 H293 / 22.10. 15 30 45 1.58 31 2.63 10 1.2 1.2 1.7 35.0 26.3
2 H293 / 23.10. 13 26 39 1.37 25 2.12 10 1.2 1.2 1.7 28.8 21.6

तालिका 2 खूंटी वर्षण की अनुकरणीय प्रोटोकॉल.

Discussion

एक उपयुक्त IgY शुद्धि विधि का चुनाव शुद्धि (प्रयोगशाला या औद्योगिक), लागत प्रभावशीलता, तकनीक (प्रयोगशाला उपकरण), और पर्यावरण (कचरा प्रबंधन) पर प्रभाव के पैमाने से प्रभावित है. विभिन्न IgY निष्कर्षण तरीकों में विस्तार से डी Meulenaer और Huyghebaert (2001, समीक्षा के लिए भी Schade एट अल 2005.) द्वारा की समीक्षा की गई. सामान्य में, इन तरीकों को तीन प्रमुख समूहों में विभाजित किया जा सकता है:

  1. वर्षा तरीकों: अमोनियम या सोडियम सल्फेट, polyethyleneglycol (खूंटी), caprylic एसिड और caragenean शामिल है .
  2. Chromatographic तरीकों: आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी, आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, hydrophobic बातचीत क्रोमैटोग्राफी, thiophylic बातचीत क्रोमैटोग्राफी, और जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी.
  3. Ultrafiltration.

एक IgY तैयारी की पवित्रता तरीकों का एक संयोजन द्वारा बढ़ाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, खूंटी वर्षण आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के साथ संयुक्त किया जा सकता है है. कुछ उदाहरणों में, अंतिम आवेदन के आधार पर, IgY का पानी निकालने के लिए अच्छे परिणाम (अकिता और Nakai 1993) को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है. हमारे अनुभव के अनुसार, IgY नमूना हम खूंटी - वर्षण द्वारा प्राप्त विभिन्न प्रतिरक्षाविज्ञानी assays के एक बहुत में बहुत अच्छी तरह से काम किया. खूंटी - वर्षण विधि का मानकीकरण करके एक तकनीकी सहायक के लिए प्रति सप्ताह लगभग 84 अंडे, जो 4 और 7 ग्राम प्रति सप्ताह के बीच कुल IgY की राशि से मेल खाती है है की प्रक्रिया में सक्षम है. एक साधारण गणना: एक बिछाने मुर्गी एक प्रतिजन के साथ प्रतिरक्षित किया गया है. कुछ को बढ़ावा देने के टीकाकरण के बाद मुर्गी 1:50,000 के एक titre के साथ 30 दिनों की अवधि के दौरान विशिष्ट एंटीबॉडी (अब) का उत्पादन. 30 एक्स 2 मिलीलीटर IgY निकालने अंडे (प्रोटोकॉल और छवि 3. देखें) 60 मिलीलीटर कुल IgY, जो बारी में 3,000 एल के अब के कमजोर पड़ने (एक बाल्टी की क्षमता 10 एल है) से मेल खाती है कि 3,000 एल के साथ इसका मतलब से मेल खाती है है अब समाधान के 300 बाल्टी भरा जा सकता है. तो, इतनी बड़ी अब मात्रा के दृश्य में यह कोई समस्या लगातार गुणवत्ता और विशिष्टता के अब पूल की दुकान है. इस तकनीक प्रभारी / बहुत अन्यथा polyspecific अब में मनाया परिवर्तनशीलता को कम कर देता है.

स्तनधारी पूरक व्यवस्था के कोई सक्रियण, HAMA (मानव विरोधी माउस एंटीबॉडी), रुमेटी कारकों या मानव रक्त समूह प्रतिजनों (heteroagglutinins की कमी) के साथ कोई पार जेट: मात्रा के पहलू के बावजूद, IgY अब स्तनधारी आईजीजी के साथ तुलना में आगे फायदे हैं.

IgY - अब के एक उत्कृष्ट लाभ तथाकथित वंशावली दूरी है. जातिवृत्तिक दूरी अब स्तनधारियों और मुर्गियों के specificities के बीच अक्सर वर्णित अंतर के लिए कारण है, जब भी हूबहू प्रतिरक्षित. स्तनधारी और एवियन प्रतिरक्षा प्रणाली स्वयं के बीच मतभेद के अलावा, वंशावली के विकास में इन दो जानवरों की कक्षाओं में मतभेद अलग अब specificities के लिए योगदान देता है. कई लेखकों को सूचित किया है कि मुर्गियों अक्सर जातीवृति के आधार पर उच्च संरक्षित स्तनधारी प्रोटीन या पेप्टाइड्स के खिलाफ Abs अधिक कुशलता से खरगोश (समीक्षा के लिए देख Schade एट ए 2005) की तुलना में उत्पादन. एक परिणाम के रूप में, एक संरक्षित प्रतिजन "नकाबपोश" खरगोश प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए रह सकते हैं, और इस प्रकार केवल एक कमजोर या एक "मूक" प्रतिक्रिया का कारण. इसके अलावा, अगर मुर्गियों और खरगोशों ही स्तनधारी प्रतिजन के साथ प्रतिरक्षित कर रहे हैं, बहुत बार मुर्गियों एक अब - विशिष्टता है कि शायद ही कभी खरगोश में प्राप्त किया जा सकता है के साथ जवाब. इसके अलावा पशु कल्याण के पहलू महत्वपूर्ण है क्योंकि अब गैर invasively अंडे की जर्दी से निकाली गई. जीन गन प्रतिरक्षण (प्लाज्मिड) के साथ संयोजन में IgY उत्पादन पूरी तरह से गैर इनवेसिव (Witkowski एट अल 2009) है .

अंत में, मुर्गियाँ और खूंटी - वर्षण की माध्यम से IgY-निष्कर्षण में अब के उत्पादन बहुत लागत प्रभावी है और स्थिर titres के साथ 1:1,000,000 के लिए अत्यधिक विशिष्ट अब में परिणाम है. एविस और स्तनीयजन्तु बीच वंशावली दूरी के कारण, चिकन जैसे खरगोश के लिए इसके विपरीत में अत्यधिक संरक्षित स्तनधारी प्रतिजनों के खिलाफ विशिष्ट अब उत्पादन करने में सक्षम हैं. अब की असाधारण राशि IgY प्रौद्योगिकी द्वारा प्राप्त दरवाजा भी खुल चिकित्सीय / रोगनिरोधी प्रयोजनों के लिए मानव और पशु चिकित्सा में IgY - अब का उपयोग करने के लिए.

Disclosures

जानवरों पर प्रयोगों Landesamt फर Gesundheit und Soziales बर्लिन (0069/03 एच) द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.

Acknowledgments

इस काम के जर्मन संघीय मंत्रालय शिक्षा और अनुसंधान से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (परियोजना BiGRUDI [द्विपक्षीय ologische जी efahrenlagen: आर isikobewertung, यू ltraschnelle डी etektion und मैं dentifizierung वॉन bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594] ). हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए बी Diemar (Charité Universitätsmedizin बर्लिन, Institut für Pharmakologie) धन्यवाद.

Materials

  1. Dialyse Bag Visking, Type 27/32, cut off -14 kD, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
  2. Falcon tubes Blue Max, 50 ml Polypropylene Conical Tube, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes NY, USA
  3. Folded Filter MN 615 ¼, 150 mm, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany Heraeus
  4. Magnetic stirrer, Variomag Mono, H+P Labortechnik AG, Oberschleißheim, Germany
  5. Micro-Dialyse-Capsule 5,0 ml, Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
  6. Multifuge 3SR+, Thermo Scientific, Langenselbold, Germany
  7. Photometer UV-160A, Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Germany
  8. Polyethylene Glycol 6000, Rotipuran Ph. Eur., Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany
  9. Premixed PBS-Buffer 10x, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany
  10. Roller Mixer SRT2, Stuart, Staffordshire, UK
  11. Vibrofix VF2, Janke & Kunkel, IKA-Labortechnik, Staufen i.Br., Germany
  12. Yolk spoon, Fackelmann (houshold effects), Germany

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References

  1. Akita, E. M., Nakai, S. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain. J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).
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  3. Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27, 183-193 (2006).
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  7. Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).
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Cite this Article

Pauly, D., Chacana, P. A., Calzado, E. G., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation. J. Vis. Exp. (51), e3084, doi:10.3791/3084 (2011).More

Pauly, D., Chacana, P. A., Calzado, E. G., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation. J. Vis. Exp. (51), e3084, doi:10.3791/3084 (2011).

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