Summary
Un metodo è descritto per la preparazione di un 3-dimensionale matrice costituita da collagene di tipo I e di fibroblasti umani primari. Questo gel organotipica serve come substrato utile per valutare la migrazione delle cellule invasive perché imita caratteristiche di base di stroma tissutale ed è suscettibile di molte forme di microscopia.
Abstract
Migrazione cellulare è fondamentale per molti aspetti della biologia, compreso lo sviluppo, la guarigione delle ferite, le risposte cellulari del sistema immunitario, e metastasi delle cellule tumorali. La migrazione è stata studiata su vetrini in modo da rendere dinamiche cellulari suscettibili di indagine al microscopio ottico. Tuttavia, è diventato chiaro che molti aspetti della migrazione cellulare dipendono caratteristiche dell'ambiente locale compresa la sua elasticità, composizione proteica, e la dimensione dei pori, che non sono fedelmente rappresentati da due substrati rigidi dimensionali quali vetro e plastica 1. Inoltre, l'interazione con altri tipi di cellule, inclusi i fibroblasti stromali e cellule immunitarie 2, 3 ha dimostrato di giocare un ruolo critico nel promuovere l'invasione delle cellule tumorali. Indagine a livello molecolare ha sempre dimostrato che dinamica molecolare, compresa la risposta al trattamento farmacologico, di cellule identiche sono significativamente differenti rispetto
Idealmente, sarebbe meglio studiare la migrazione cellulare nel suo contesto naturale in organismi viventi, tuttavia questo non è sempre possibile. Intermedi sistemi di coltura di tessuti, come matrice cellulare derivata, Matrigel, coltura organotipica (descritto qui) espianti tissutali, organoidi, xenotrapianti, e sono quindi importanti intermedi sperimentali. Questi aspetti approssimativi sistemi certi di un ambiente in vivo, ma sono più suscettibili di manipolazione sperimentale come l'uso di linee cellulari stabilmente trasfettate, regimi di trattamento farmacologico, a lungo termine e ad alta risoluzione delle immagini. Tali sistemi intermedi sono particolarmente utili come terreni di prova per convalidare le sonde e stabilire i parametri necessari per l'immagine della risposta dinamica di cellule fluorescenti e giornalisti, prima di effettuare l'imaging in vivo 5. Come tali, essi possono svolgere un ruolo importante nel ridurre la necessità di esperimenti su living animali.
Protocol
1. Istituzione di colture di fibroblasti da espianti di pelle
- 4 biopsie millimetri punzone acquisiti da avambraccio umano sono posti in MEM addizionato 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 0,25 mcg / ml Fungizone.
- Tagliare il grasso sottocutaneo e tritare finemente la biopsia in piccoli pezzi da dondolo 24 lama di bisturi numero contro il fondo della capsula di Petri.
- Tessuto slurry posto in un centimetro 25 2 pallone di coltura tissutale con mezzi primari di crescita dei fibroblasti (MEM supplementato con 10% FCS, 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 25 ug / ml Fungizone) aggiunto finché la superficie del pallone è coperto ma la profondità del liquido è insufficiente per il tessuto a stare a galla.
- Seguendo tre giorni di incubazione a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2, aggiungere 3 ml di mezzo di crescita dei fibroblasti primari.
- Dopo un altro giorno 3 Media cambiamento di incubazione con i media fibroblasti primari di crescita fresche, o se cells sono quasi confluenti possono essere suddivisi 01:04 in mezzi freschi. (Fungizone può essere omesso da questo punto in poi).
2. Fase I - Preparazione del collagene I di code di ratto
Nota: protocollo per circa 12-14 code di ratto adolescente (freschi o surgelati)
- Preparare coda di ratto mediante lavaggio in 70% etanolo e rimuovere tendini come segue:
- Rimuovere la pelle dal coda di ratto mediante tranciatura nel mezzo della coda da cima a fondo con un bisturi e pealing lungo la lunghezza della coda.
- Tendine staccare dal nucleo della regione prossimale della coda.
- Rimuovere tendine verso la regione distale della coda evitando la guaina con pinze dentate.
- 1 g di estratto tendine / 250 ml di 0,5 M di acido acetico agitazione a 4 ° C per 48 h.
- Centrifugare l'estratto (7.500 xg) per 30 minuti e scartare il pellet.
- Aggiungere un volume uguale del 10% (w / v) NaCl al supernatante, e agitare per 30-60 min.
- Dializza la soluzione di collagene contro 6-8 cambi di 6L ~ 17,5 mM di acido acetico (1 ml di acido acetico glaciale per litro di acqua fredda, modifica 2 x al giorno).
- Centrifugare collagene dializzato a 30.000 xg per 1,5 ore.
- Rimuovere il surnatante e mettere in beuta sterile.
- Regolare la concentrazione di collagene I ~ 2 mg / ml usando acido acetico 0,5 mM a 4 ° C.
3. Fase II - Creare la matrice 3D con fibroblasti incorporati consentono di contrarre (per 8 giorni).
- Assemblare il mix utilizzando reagenti freddi a 4 ° C in un pre-refrigerati bottiglia. I collagen mantenere in ghiaccio.
- Per una T75 pallone confluenti fibroblasti primari (~ cella numero 1 x 10 6) uso:
- 25 ml di collagene coda di ratto (ca. conc 2mg/ml)
- 3 ml 10xMEM
- 0,22 M di NaOH: in primo luogo, aggiungere 2 ml, poi goccia a goccia sotto agitazione, fino a quando il collagene diventa arancione,
- ma non rosa (solitamente fino a 3 ml). Approssimativo p H = 7.2.
- Nota: è importante garantire che il mezzo / gel rimane neutro o leggermente acido come fibroblasti non contrarre il gel se esposto a condizioni anche leggermente alcaline.
- Trypsinise i fibroblasti, centrifugare a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
- Durante la centrifuga ad oltre 5 minuti: Preparare 12 x 35 piatti di plastica mm - consegue normalmente 12 piatti da un pallone di fibroblasti / mix collagene.
- Risospendere fibroblasti in 3 ml di FCS e aggiungere immediatamente alla miscela di collagene e mescolare.
- Piastra di circa 2,5 ml di collagene / fibroblasti a piatto più rapidamente possibile. Cercate di evitare le bolle e le impostazioni di collagene.
- Lasciare che il collagene impostato a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% di CO 2 in aria per 10 minuti.
- Aggiungere 1 ml di fibroblasti crescere° media (DMEM + 10% FCS).
- Staccare il collagene / fibroblasti matrice dai lati del piatto con una pipetta.
- Il giorno dopo: Aggiungere 1 ml di terreni di crescita dei fibroblasti (DMEM + 10% FCS).
- Cambiare i media ogni due giorni. Consenti collagene / fibroblasti matrice a contrarre per circa 8 giorni, fino a quando si inseriscono in un piatto da 24 pozzetti (Contrazione da ~ 3,5 cm a 1,5 cm di diametro, si veda la Figura 1).
Nota: La concentrazione di collagene deve essere regolata secondo l'applicazione. Il più diluire la soluzione di collagene, più veloce sarà contratto dai fibroblasti. Leggere differenze di velocità di contrazione sarà sperimentato con differenti lotti di collagene alla stessa concentrazione. Allo stesso modo, diverse colture di fibroblasti di contrarre il gel di collagene a ritmi diversi, i fibroblasti e più presenti, più veloce è il tasso di contrazione. Concentrazione di collagene e densità dei fibroblasti possono quindi, regolato per modificare la velocità di contrazione,e la densità finale del gel di collagene.
4. Fase II - cellule Placcatura di interesse sulla parte superiore della matrice
Nota: Sterilizzare tutti pinze e le attrezzature con etanolo prima dell'uso.
- Utilizzando pinze smussato, spostare delicatamente matrice contratto a 24-ben piatto. Assicurarsi che non si piega.
- Preparare la sospensione di cellule di interesse a circa 4 x 10 1 ml 4 / ml e la piastra (dopo che le cellule trypsinising, di selezione per sbarazzarsi di tripsina) sulla parte superiore della matrice. Numero effettivo di cellule necessarie varierà a seconda del tipo cellulare utilizzato. Medie cellulare dovrebbe essere medio normale crescita per le cellule di interesse.
- Permettere alle cellule di crescere fino a confluenza in cima alla matrice, circa 3-5 giorni.
5. Fase III - Trasferire la matrice di una griglia per l'invasione (circa 0-21 giorni)
- Tagliare griglie in acciaio inox per creare un treppiede e sterilizzare in autoclave prima dell'uso (vedere la figura 2).
- Mettere in rete sterilePiatto 6 cm, aggiungere mezzi di crescita ad un livello sopra la griglia (circa 10.5ml). Matrix posto sulla griglia e delicatamente aspirare supporti modo che il fondo della matrice è in contatto con i media ma non sommersa. Questo è indicato come l'aria / interfaccia liquido, che crea un gradiente che promuove invasione. Sostituire media ogni due giorni (vedi figura 2).
- Vivo delle cellule, l'imaging contestuale utilizzando cellule fluorescenti possono essere esposte in questa fase o precedenti. Il collagene contratto o fibrillare che è possibile creare immagini utilizzando generazione di seconda armonica (SHG, vedi figura 3). Utilizzo multi-fotone di eccitazione combinata con ampio campo di rilevamento si trova che SHG possono essere esposte ad almeno 100 micron nella matrice, mentre le cellule che esprimono GFP citoplasmatica è possibile creare immagini di almeno 200 micron di profondità.
Nota: Per quanto riguarda la quantificazione di invasione, il giorno in cui sono posti da matrici sulle griglie definisce Giorno 0. Posizionamento su griglie genera un gradiente di terreni di coltura delle cellule che promuove int invasione o la matrice. I campioni possono essere ripreso nei prossimi 1-21 giorni (o più) la valutazione dei processi biologici come l'invasione, la proliferazione, la sopravvivenza o la differenziazione (Vedi tabella).
6. Fase IV - Fissazione
- Aggiungere 5 ml del 4% PFA in un tubo Falcon.
- Trasferire la matrice su una superficie piana. Tagliare la matrice a metà con un fresco pulito bisturi (come si sarà colorazione la sezione trasversale), sollevare la matrice con bisturi e trasferimento al 4% PFA, fissare per tutta la notte.
- Matrici organotipiche sono ora pronti a macchiare con l'anticorpo / macchia di scelta (vedi Figura 3).
7. Rappresentante dei risultati:
Figura 1 Esempio di fibroblasti-contratto Miscela collagene I. fibroblasti collagene e della coda di ratto staccato dalla capsula di Petri e ha permesso di contrarre più di 6-8 giorni.
Figura 2 "src =" / files/ftp_upload/3089/3089fig2.jpg "/>
Figura 2 progressione organotipica dosaggio. A, schematica di set up organotipica e progressione. B, Esempio di collagene / fibroblasti matrice sopra di acciaio inossidabile, griglia sterile per creare interfaccia aria / liquido.
Figura 3 Applicazioni di test organotipica. A, B non invasive e invasive pancreatiche duttali adenocarcinoma (PDAC) invade le cellule nel tempo con matrice organotipica. C, vita equivalente della pelle che mostra una epidermide stratificata su un fibroblasto-contratto componente collagene dermico. D, C8161 cellule di melanoma che invadono per un fibroblasto -contratto collagene dermico equivalente. E, invasive cellule PDAC (verde) che interagiscono e invadere con fibroblasti (rosso) all'interno della matrice organotipica. F
Discussion
Presentiamo qui un metodo per la produzione di una matrice 3-dimensionale adatto per studi di migrazione cellulare invasiva 6-8. La matrice è costituita da collagene di tipo 1 fibrille in subappalto per un periodo di diversi giorni da fibroblasti umani primari epidermiche. Il collagene è preparato mediante estrazione acida non, digestione enzimatica, che conserva reattività alle poli-peptide estremità e promuove reticolazione delle fibrille di collagene in grandi aggregati upon neutralizzazione di condizioni del tampone 9. Ciò comporta una ricostituito gel che più strettamente simula le funzioni di collagene in vivo e ha conseguenze importanti per le proprietà invasive delle cellule coltivate in gel. Non importa se fresco o congelato materiale di partenza viene utilizzato, ma l'uso di code di ratto adolescenti è importante perché il collagene cross-linking è più labile in animali più giovani. Collagene I da animali più giovani è quindi più facile da estrarre, e ri-costituisce with alta fedeltà.
La matrice di collagene può essere fissate e colorate con anticorpi diretti contro sia cellule tumorali invasive o fibroblasti stromali 2,10 e sono molto utili per testare l'efficacia dei farmaci che possono inibire l'invasione 5,6.
Sebbene questo protocollo suggerisce l'uso di fibroblasti umani primari, è possibile utilizzare fibroblasti primari da altri tipi di tessuto, a seconda del tipo di tessuto in esame. È anche possibile stabilire culture utilizzando fibroblasti immortalizzate, comprese le cellule che sono state stabilmente trasfettate con coniugati proteina fluorescente. In questo modo le cellule stromali e sia tumore può essere etichettato per visualizzare interazioni cellulari durante invasione 11.
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x MEM | GIBCO, by Life Technologies | 21430 | - |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 367176-500G | Prepare 0.22 M stock in water |
| FCS | PAA Laboratories | A15-101 | - |
| 35 mm dishes | Falcon BD | 353001 | For step 3.4 |
| 60 mm dishes | Falcon BD | 353004 | For step 5.2 |
| Spring forceps blunt | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | E003/02 | Toothed, not smooth |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% in PBS prior to use |
| Screens for cd-1, size 40 mesh | Sigma-Aldrich | S07707-5EA | Stainless steel grids, 5 per pack |
| Dialysis tubing | Medicell International | 7607 2295 | 12 - 14 kD |
| PBS | Oxford Labware | BR0014G | - |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | - |
| 24 well dish | Falcon BD | 353047 | For step 4.1 |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | - |
References
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