Summary
Mycobacterium tuberculosis Antimikrobiyal duyarlılık testi zor ama hasta bakımı için kritik. Bu mikrotiter plate formatı 12 antimikobakteriyel ilaçların test sunar ve uygun tedavi yardımcı olacak minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değerleri sağlar.
Abstract
Antimikrobiyal direnç hızlı algılama dirençli Mycobacterium tuberculosis (MTB) artışı kontrol etmek için çaba önemlidir. MTB antimikrobiyal duyarlılık testleri (AST), geleneksel oran agar yöntemi veya macrobroth test / BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) veya BacT gibi bir araç tarafından yapılmıştır ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). Agar oranı yöntemi olarak kabul ederken, AST "altın" standardı, yoğun emek ve uyuşturucu ücretsiz agar göre uyuşturucu içeren agar üzerinde koloni sayımı yaparak direnç hesaplama gerektirir. Uyuşturucu ücretsiz orta karşılaştırıldığında ilaç içeren orta ≥% 1 büyüme varsa, organizma o ilaca dirençli olarak kabul edilir. Macrobroth yöntemleri enstrümantasyon ve ilk satırı ilaçlar için test kırılma noktası ("kritik") ilaç konsantrasyonları (izoniazid, etambutol, rifampin ve pirazinamid) gerektirir. Burada anlatılan yöntemi 96 mikrotiter plate formatında piyasada bulunan [MYCOTB (TREK Diagnostics)] ve amikasin (her ikisi de ilk (izoniazid, rifampin, etambutol) ve ikinci basamak ilaçlar da dahil olmak üzere, tüberküloz tedavisinde kullanılan 12 antimikrobiyaller artan konsantrasyonlarda içeren, sikloserin, etionamid, kanamisin, moksifloksasin, ofloksasin, para-aminosalisilik asit, rifabutin, ve streptomisin). Pirazinamid, ilk satırı ilaç, asidik test koşulları için ihtiyacı nedeniyle mikrotiter plate dahil değildir. Mikrotiter sistemin avantajları, hem de kurmak kolaylığı ve geleneksel agar oranı (21 gün) ile karşılaştırıldığında daha hızlı dönüş süresi (14 gün) içerir. Buna ek olarak, et suyu ya da katı besiyeri kullanılarak hazırlanan inokulum plaka kurmak olabilir. Mikrotiter plate formatı yeni ve MTB laboratuvar benzersiz güvenlik sorunları beri, bu protokol, güvenli bir şekilde kurulum nasıl anlatacağız bu yana, inkübasyon ve mikrotiter plate okuyun.
Protocol
Her laboratuvar, inokulum hazırlanması ve plaka içine inokulum pipetleme için uygun bir biyogüvenlik seviyesini belirlemek için bir risk değerlendirmesi Kurumsal Biyolojik Güvenlik Görevlisi ile işbirliği içinde yerine getirmesi gerekir. Microtiter plakalar inoküle ve plastik bir yapıştırıcı mührü ile mühürlenmiş kadar laboratuar, 3 laboratuvar (BSL3) uygulamaları biyogüvenlik düzeyi kullanabilir. Bu plakalar daha sonra ısı da kapalı bir plastik torba içine yerleştirilir. Kuluçka ve yorumlama okuma mikrotiter plate bir biyogüvenlik düzeyi 2 laboratuvar (BSL2) yapılır.
1. Malzemelerin Etiketleme
- Etiket kan agar plaka, üç Middlebrook 7H10 plakaları, Middlebrook 7H9 suyu, tuzlu su arasında cam boncuk tüp ve BSL2 uygun tanımlayıcılar (örneğin, hasta ismi, tıbbi kayıt numarası) ile mikrotiter AST plaka.
- Etiket kanlı agar ve "saflık onay" olarak kaplama 7H10. Inokulum Periyodik koloni sayımı, organizmaların uygun bir konsantrasyon testte kullanılan olmasını sağlamak için tavsiye edilir. Yapılan koloni sayımı "1 / 1 koloni sayısı" ve "1 / 50 koloni sayısı" ile etiketlenmiş 7H10 plakaları iki olması gerekir.
2. BSL3 gitmek Teknolog hazırlıkları
- Uygun kişisel koruyucu ekipmanlar BSL3 çalışması için gerekli olan ve katı ön cüppe, baş örtüsü, eldiven, galoş ve bir maske içerir. Her kurum, kendi kurumu Endüstriyel Hijyen görevlisi ile işbirliği içinde kendi solunum koruma planı oluşturmalıdır. Laboratuvarımızda, motorlu hava temizleme respiratörleri (PAPRs) ve HEPA filtreden donatılmış, N95, yarım yüz gaz maskeleri de dahil olmak üzere çeşitli solunum maskeleri ve var.
3. Biyolojik güvenlik kabini hazırlanması
- BSL3, yüzey dezenfeksiyon ve yaklaşık 6 inç havalandırma panelinden dezenfektan ile ıslatılmış kağıt havlu yerleştirerek biyolojik güvenlik kabini (BSC) hazırlamak.
- Sol tarafta bir atık kabı ve sağ tarafta küçük nephlometer ve vortexer yerleştirin.
- Aşılamak döngüler, pipetors ve ipuçları kağıt havlu yanında.
- Organizma (et suyu veya katı orta) ve kağıt havlu üzerine McFarland 0.5 standart bir raf yerleştirin.
4. Nephelometeri Kalibrasyonu
- Nephelometeri tuzlu arasındaki cam boncuk tüp yerleştirin ve tuzlu arasındaki boş kullanarak sıfır araç ayarlamak.
- Nephelometeri McFarland 0.5 standart yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre kalibre.
5. İnokulum Hazırlanması
- ≥ 0.5 McFarland Standart elde edilinceye kadar uygun etiketli tuzlu arasındaki cam boncuk tüp içerisine steril bir döngü kullanarak katı orta BSC, kazıma koloniler çalışmak.
- Görme örnek incelemek ve McFarland Standart karşılaştırın.
- 30-60 saniye için Vortex örnek.
- 15 dakika boyunca yerleşmek için bir zamanlayıcı ayarlamak inokulum izin verin.
6. Mikrotiter plate Aşılanması
- McFarland 0.5, 4.1 ve 4.2 adımları kalibre nephelometeri kullanarak tuzlu arasında suyu ile inokulum ayarlayın. Bu 30 dakika (ortalama üretici özellikleri) içinde tamamlanması gerekir.
- 200 mcL pipetter ve tuzlu boncuk arasındaki tüp TOP 1 / 3 üncü inokulum 100 mcL kaldırmak için bir UZUN aerosol dayanıklı pipetlemeyin ucu kullanın. Middlebrook 7H9 Broth inoküle edin. 20 saniye boyunca inoküle 7H9 suyu yavaş yavaş girdap.
- AST mikrotiter plate üreticinin paketinden çıkarın. Folyo paket hasarlı ise kurutucu mavi veya kullanmayın.
- 01:50 seyreltme hazırlanmasında daha sonra kullanmak üzere steril bir tüpe steril su 50 mcL pipetleme 1:50 sulandırma tüpü hazırlayın.
- 7H9 broth inokulum bir çukur içine dikkatlice dökün. AEROSOLS JENERATÖR KAÇININ.
- AST mikrotiter plate etiketi ile karşı karşıya koyun.
- 12-kanal pipetter, her bir kuyunun 100 mcL inokulum eklemek için kullanın.
- Koloni sayımı için dilüsyonları hazırlayın:
- 1 / 1 seyreltme, "1 / 1" etiketli 7H10 plaka üzerinde 1 ul döngü şeritli de pozitif kontrol (H12) hazırlanır.
- 1 / 50 dilüsyon de pozitif kontrol (H12) 1 ul döngü yukarıda hazırlanan su borusu 50 ul ile aşılama ve tüp içine dönen tarafından hazırlanmıştır. Bu seyreltme plaka Streak 1 mcL "1 / 50" olarak etiketlenmiş.
- Uygun bir şekilde etiketlenmiş kanlı agar ve 7H10 plaka ve izolasyonu için çizgi üzerine 50 mcL pipetleme çukur saflığı plakalarını aşılamak.
- YerAST mikrotiter plate üzerinde yapışkan bir mühür. Beyaz arka mühür kullanılarak yeterli sızdırmazlık sağlamak için her bir kuyunun üzerine sıkıca bastırın. Kırışıklıkların oluşmasını önlemek.
- Mikrotiter plate bir ısı mühür veya bant ile plastik bir torba ve yakın bir tüberkülsit dezenfektan ve yer mikrotiter plate ile ıslatılmış kağıt havlu ile silinerek dezenfekte edin.
- Plastik torba birincil plakanın bir sızıntı veya dökülme var olmalıdır tüm suyu yer olduğundan emin olmak için ikincil bir konteyner olarak hizmet vermektedir.
7. Malzemelerin dezenfeksiyonu ve biyolojik güvenlik kabini
- Aerosollerin üretimi önlemek için hafifçe atmak konteyner içine koymadan önce başka bir çukur inoküle çukur üstüne yerleştirin.
- Tüberkülsit bir dezenfektan ile silerek nephlometer, vortexer, tabak, tüpler, vb de dahil olmak üzere tüm malzemeler dezenfekte edin ve üreticinin talimatlarına göre BSC çıkarmadan önce dezenfeksiyon sigortalamak için uygun zamanı bekleyin. Örneğin, Prospray, kullandığımız tüberkülsit dezenfektan, mikobakteriler öldürmek için 15 dakika gerektirir.
- Otoklav önce, bir biohazard çanta ve mühür atın kap yerleştirin.
8. Kuluçka
- Tabaklar medya ile aşağı inkübe edilmelidir ve bakım, herhangi bir sıvı dökmekten veya sıçramasını önlemek için alınmalıdır.
- 35-37 ° C inkübatör AST mikrotiter tabak tabak, 7H10 ve kan agar plaklarına BSL2 laboratuar% 5-10 CO 2 ile% 5-10 CO 2 ile inkübe edin.
- Plaka iyi kapalı ve mühürlü bir plastik torba içinde, çünkü bizim laboratuar, bu kabul edilebilir.
- 2'den fazla mikrotiter AST plakaları, üreticinin talimatlarına göre kuvöz yığılmış olmalıdır.
9 - Temsilcisi sonuçları
Sonuçların yorumlanması:Mühürlü AST microtiter plakalar elle bir ayna kullanarak, bir yardımcı olarak ya da Vizyonumuz (TREK Diagnostics) gibi bir otomatik plaka okuyucu ile okunabilir. Plakalar aşılama sonra en kısa sürede 7 gün olarak incelenebilir. (Yani, iyi altındaki hücreleri mevduat) pozitif olup olmadığını belirlemek için, H11 ve H12 pozisyonları büyümesini kontrol kuyuları inceleyin. Büyümesini kontrol kuyuları olumlu değilse, plaka reincubate ve büyümesini kontrol kuyuları pozitif olana kadar (örneğin, 10 gün, 14 gün) periyodik olarak yeniden gözden.
- Ayna okuyun:
- Platform üzerine yerleştirin AST mikrotiter plate mühürlü;
- 7 gün inkübasyondan sonra büyümesini kontrol kuyuları okuyun; bu negatif, reincubate AST mikrotiter plate ise;
- Büyümesini kontrol eden kabul edilebilir ise, o zaman ilaç içeren kuyu okuyun. Her ilaç için, büyüme, büyüme kontrolü ile ilaç kuyu karşılaştırarak ilk seyreltme kaydedin.
- Büyüme, bulanıklık gibi ya da bir kuyunun dibinde hücreleri bir depozito olarak görünür.
- Enstrüman okuyun: üreticileri yönergeleri izleyin; aşağıdaki talimatları okuma Vizyonumuz platformu ile ne yapılabilir bir örnektir:
- Giriş yap
- "MYCOTB" AST plaka yazılımı kullanın.
- Kullanıcı bakan barkod ile mühürlü plaka koyun. Büyüme, bulanıklık gibi ya da bir kuyunun dibinde hücreleri bir depozito olarak görünür.
- Büyümesini kontrol eden bu negatif, reincubate AST mikrotiter plate ise; pozitif büyüme göstermez, her ilacın ilk sıra ile ekrana dokunarak plaka okursanız.
Saflık plakaları okuyun. Kan agar plaka 48 saat sonra, herhangi bir büyüme göstermesi gerekir ve 7H10 saflık plakası, bir organizma türü konfluent büyüme olmalıdır. Kontamine olursa, AST mikrotiter testi saf kültür tekrarlanması gerekir.
Aşağıdaki tabloyu kullanarak pozitif kontrol koloni sayıları hesaplayın:
Colony Sayısı Anahtar
| # Koloniler "1 / 1" etiketli plaka sayılır | # Koloniler sayılır "1 / 50" etiketli plaka | İnokulum Koloni Sayısı (kob / ml) |
| <50 | 0 | <5 X 10 4 |
| 50-100 | 0-2 | 5 X 04-1 Ekim X 10 5 |
| > 100 | ≤ 10 | 1 X 10 5 5 X 10 5 |
| > 100 | > 10 | > 5 X 10 5 |
Mycobacterium tuberculo bazı suşları para-aminosalisilik asit ile sondaki olabilirsis. Bu pelet var tüm kuyu bakıyor ve bitiş noktası olarak bir sonraki seyreltme aynı boyutta pelet ilk iyi kullanarak yorumlanabilir. Direnç, bu ilaç ile nadirdir.
Şekil 1. MYCOTB plaka kullanarak Temsilcisi sonuçlanır.
| İlaç kısaltma | Ilaç | MIC μ / ml |
| Odasındaki | ofloksasin | 16 |
| MXF | moksifloksasin | 8 |
| RIF | rifampin | > 16 |
| AMI | amikasin | 0,5 |
| STR | streptomisin | 16 |
| RFB | rifabutinin | 8 |
| PAS | p-aminosalisilik asit | ≤ 0.5 |
| ETH | etionamid | 5 |
| CYC | sikloserin | 4 |
| INH | izoniazid | 2 |
| KAN | kanamisin | 1,2 |
| EMB | etambutol | 4,0 |
Discussion
Bir AST mikrotiter plate pozitif büyüme kontrolleri bir örnek Şekil 1'de gösterildiği ve uç nokta her ilaç için MIC (mcg / ml) daire. Laboratuvarımızda yapılan bir çalışmada AST mikrotiter plate yöntemi Mycobacterium tuberculosis duyarlılık testi için altın standart agar oranı yöntemi eşdeğer olduğunu belirtti. AST mikrotiter plate ve agar oranı yöntemi 14 ve 21 gün için son yorumu ile geleneksel agar oranı yöntemine göre sonuçların daha hızlı raporlama mikrotiter AST mikrotiter plate ile elde edildi, respectively.The AST mikrotiter plate ilk test avantajı vardır ikinci satırda aynı anda ilaçlara dirençli suşlar ile haddini gecikmeler önlemeye yardımcı olabilir. AST mikrotiter plate de APM daha kurmak ve okumak çok daha kolay ve Vizyonumuz gibi manuel ayna ve yarı otomatik bir sistem plakaları okumak için kullanılır. TB ilaç direnç testi için MIC değeri durumu, özellikle "borderline" duyarlılığı olanlar izolatları için, geleneksel kritik konsantrasyon değerine göre hekimlere değerli yeni bilgiler verebilir.
Disclosures
Ifşa etmek için hiçbir şey yoktur.
Acknowledgments
Biz çalışma sırasında, yardım ettikleri için Mayo Clinic tüberküloz Laboratuvarı, laboratuvar teknologlar teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AST microtiter plates and adhesive seal | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | MYCOTB | |
| McFarland 0.5 standard | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | E1041 | |
| Middlebrook 7H10 plates | Fisher Scientific | ||
| Blood Agar Plates | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 1 μL | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 10 μL | Fisher Scientific | ||
| Sensititre Saline-Tween glass bead broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | 27143 | |
| 7H9 OADC Broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | T3440 | |
| Long Pipet Tips | Fisher Scientific | ||
| Sterile Troughs | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | ||
| M. tuberculosis | ATCC | 27294 | |
| Pipeters: 1000, 200, 20μL | Fisher Scientific | ||
| Tips 1000, 20, 20 μL | Fisher Scientific | ||
| Multichannel Pipetter | Fisher Scientific | ||
| Incubator 5-10% CO2 | Fisher Scientific | ||
| Plastic bags, small, CO2 permeable | Poly Plastic Products | ||
| TB disinfectant (Such as ProSpray C-60) | Certol International, Commerce City, CO | PSC60/32 | |
| Mirror Box Reader | Fisher Scientific |
References
- Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).
- HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions. , 5th Edition, National Institutes of Health. (2009).
- Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing. Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).
- Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).
- SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing. Product Insert. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. (2010).
- CLSI. Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A. , CLSI. Wayne, Pennsylvania. (2003).
- Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., Allen, S. Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB). C-151 presented at 110th American Society for Microbiology, Annual Meeting, San Diego, CA, , Abstract C-151 (2010).
- VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT. Product insert. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. 7115-7160 (2008).
- Parrish, N. M., Carroll, K. C. The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings. J Clin Microbiol. , Forthcoming (2010).
- Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance. Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).
- Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B. Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. , 9th Ed, ASM Press. Washington DC. 1223-1247 (2007).
- Bergmann, J. S., Woods, G. L. Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs. J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).
