Summary
一个可靠的和有用的方法来检测特定的植物基因组蛋白修饰的描述。该方法结合了染色质免疫沉淀（ChIP）和实时定量PCR。它允许在不同的生理过程作用，对特定的基因组蛋白修饰的检测。
Abstract
在真核生物中基因表达的调控，染色质结构是很重要的。在这个过程中，染色质重塑，DNA甲基化和共价修饰组蛋白H3和H4的氨基末端尾巴，发挥重要作用 1-2 。 H3和H4组蛋白修饰包括赖氨酸和精氨酸甲基化，乙酰赖氨酸和丝氨酸残基 1-2的磷酸化。这些修改相关的基因的激活，镇压，或支持适当的信号（微生物相关分子模式，光，激素等）3-7知觉后，更迅速和更强大的表达激活的基因，致敏状态。
在这里，我们提出了一个具体选定的植物基因的染色质修饰可靠，灵敏的检测方法。该技术是基于（修改），组蛋白与甲醛8,9，提取和修改特定抗体9,10超声染色，染色质免疫沉淀（ChIP）DNA的交联，组蛋白- DNA复合物的交联，特定基因实时定量PCR。该方法已被证明可用于检测与C 4光合作用玉米5,11和3在拟南芥中的全身免疫相关的特定组蛋白修饰。
Protocol
1。植物材料的交联
- 收获1 - 2G的拟南芥叶（6到10cm莲座直径）在50毫升的塑料管，填补了交联的缓冲区，以40ML。
- 确保叶留沉浸例如，通过量身定制的过滤海绵权馅上述缓冲表面。然后放置在干燥器管。
- 真空渗透为10分钟。每管加入2.5毫升2M甘氨酸停止交联，并反转管，以保证平等的甘氨酸分散。
- 真空渗透另一个5分钟，并丢弃液体，同时收获叶筛子。
- 洗叶两次1L水在玻璃烧杯中，然后用纸巾彻底干叶。
- 收集在一个新的塑料管的叶子和液氮冻结。商店叶在-80 ° C直到染色质隔离。
2。染色质隔离
- 叶地面砂浆和雌蕊，在液氮中保存，直到使用。
- 转让粉，50毫升的塑料管，并暂停在30ml提取缓冲液＃1。
- 在4 ° C孵育15分钟上的开销摇床。
- 滤液暂停通过四层的miracloth到一个新的50毫升的塑料管。
- 在2800 XG 20分钟旋转4 ° C。
- 去除上清液，并中止与油漆刷在1ML提取缓冲液＃2沉淀。首先添加一个缓冲区＃2，体积小，然后用画笔暂停颗粒，然后添加其余的缓冲区。
- 转移悬浮在12000 XG到1.5ml离心管和旋转为10分钟，4 ° C。
- 同时，准备液2ml离心管1.5ml的提取缓冲液＃3。
- 从纺管（步骤2.7）去除上清液，并暂停在提取缓冲液＃3300μL沉淀。首先添加一个缓冲区＃3，体积小，暂停与画笔颗粒，然后添加剩余的缓冲区。
- 仔细吸管的悬浮颗粒（步骤2.9）1.5 mL提取缓冲液中，在步骤2.8准备＃3顶部。确保两个阶段不会混合。上半年的16,000 XG旋转4 ° C。
- 去除上清液，并中止与染色质颗粒在超声缓冲液300μL的油漆刷。
- 超声sonotrode，或在超声波浴染色，一个约400bp的DNA大小。当超声，确保染色不会被加热以上约30 ° C保护热敏感的交联。需要通过实验确定，因为它变化显著不同超声设备的超声时间。为指导，提供两个不同的设备设置：
对于超声一个Bandelin品牌sonotrode暴露在0.6mL离心管中染色质的5倍至20连发设置25％的电力，周期= 50。虽然这样做，在冰浴后，每20 次阵阵清凉样品。
超声与Diagenode Bioruptor超声波浴，填补水和冰的浴缸和超声设置“高”的30秒在1.5ml的离心管的10倍。每隔30秒后，再过30秒冷却样品。
- 旋转超声16,000克的样品为5min，4 ° C至沉淀不溶物质。上清可直接用于免疫。另外，样品可在液氮中冷冻，并保存于-80℃直至进一步的冲击。
3。免疫沉淀
- 准备2 ml离心管40μL蛋白 - 琼脂糖和抗体结合缓冲液1.8mL。染色准备加入200μL（步长2.13）。
- 开销摇床孵育1h后管。
- 放弃蛋白A琼脂糖珠和使用免疫上清。
- 删除一个40μL等分，以确定染色质浓度（“输入”）。
- 加入30μL蛋白一琼脂糖和修改特异性抗体，是在特定的试剂和仪器400μL超声染色质悬浮如下表所示金额。
- 2.5H或架空摇床过夜孵育4 ° C。
- 自旋为2分钟，在440 × G.珠
- 洗珠颗粒，每个洗涤缓冲液900μL（见以下列表）。对于每一个缓冲区，然后在10分钟的缓冲开销摇床4℃，孵化珠为2分钟旋转440 XG，弃上清液，并添加下一个缓冲区。
- 低盐缓冲液洗
- 高盐缓冲液洗
- 氯化锂洗涤缓冲液
- TE缓冲液洗
- 最后一次洗涤后，彻底清除任何剩余的缓冲区。
4。组蛋白和DNA的交联和沉淀DNA纯化
- 将去交联缓冲区100μL琼脂糖颗粒和步骤3.4样品40μl的“输入”，在旋涡混合器混合5min后，旋转样品，并培育贝特在65 ° C过夜。
- 商业的DNA或PCR纯化试剂盒纯化的DNA。
- 通常情况下1:5稀释的最后一列洗脱液5μL足以执行特定常规轨迹实时定量RT - PCR（RT - qPCR的）。
5。缓冲区表
| 交联的缓冲区 | |
| 丁酸钠 | 10MM |
| 蔗糖 | 400MM |
| 的Tris - HCl，pH值8.0 | 10MM |
| β-巯基乙醇 | 5MM |
| 甲醛 | 3％（V / V） |
| 提取缓冲液＃1 | |
| 丁酸钠 | 10MM |
| 蔗糖 | 400MM |
| 的Tris - HCl，pH值8.0 | 10MM |
| β-巯基乙醇 | 5MM |
| 完整的蛋白酶抑制剂 | 1X |
| 提取缓冲液＃2 | |
| 丁酸钠 | 10MM |
| 蔗糖 | 250MM |
| 的Tris - HCl，pH值8.0 | 10MM |
| β-巯基乙醇 | 5MM |
| MgCl 2的 | 10MM |
| TRITON X - 100 | 1％（W / V） |
| 完整的蛋白酶抑制剂 | 1X |
| 提取缓冲液＃3 | |
| 丁酸钠 | 10MM |
| 蔗糖 | 1.7M |
| 的Tris - HCl，pH值8.0 | 10MM |
| β-巯基乙醇 | 5MM |
| MgCl 2的 | 2MM |
| TRITON X - 100 | 0.15％（W / V） |
| 完整的蛋白酶抑制剂 | 1X |
| 超声缓冲 | |
| 的Tris - HCl，pH值8.0 | 25MM |
| EDTA - NaOH溶液，pH值8.0 | 5MM |
| SDS | 0.5％（W / V） |
| 完整的蛋白酶抑制剂 | 1X |
| 抗体结合缓冲液 | |
| 的Tris - HCl，pH值8.0 | 50MM |
| EDTA - NaOH溶液，pH值8.0 | 1MM |
| 氯化钠 | 150MM |
| TRITON X - 100 | 0.1％（W / V） |
| 低盐缓冲液洗 | |
| 氯化钠 | 150MM |
| SDS | 0.1％（W / V） |
| TRITON X - 100 | 1％（W / V） |
| EDTA - NaOH溶液，pH值8.0 | 2MM |
| 的Tris - HCl，pH值8.0 | 20MM |
| 高盐缓冲液洗 | |
| 氯化钠 | 500MM |
| SDS | 0.1％（W / V） |
| TRITON X - 100 | 1％（W / V） |
| EDTA - NaOH溶液，pH值8.0 | 2MM |
| 的Tris - HCl，pH值8.0 | 20MM |
| 氯化锂洗涤缓冲液 | |
| 氯化锂 | 250MM |
| Nonidet - P40 | 1％（V / V） |
| 钠去氧胆 | 1％（W / V） |
| EDTA - NaOH溶液，pH值8.0 | 1MM |
| 的Tris - HCl，pH值8.0 | 20MM |
| TE缓冲液洗 | |
| EDTA - NaOH溶液，pH值8.0 | 10MM |
| 的Tris - HCl，pH值8.0 | 1MM |
| Decrosslinking缓冲区 | |
| 的Tris - HCl，pH值6.8 | 62.5mM |
| 氯化钠 | 200MM |
| SDS | 2％（W / V） |
| 数码地面电视 | 10MM |
6。代表性的成果：
拟南芥PR2防御基因的表达，编码β -1,3 -葡聚糖酶，抗菌活性 12，苯并噻二唑（BTH）诱导，人工合成的植物激素水杨酸3模拟图1表明，激活 PR2的表达与组蛋白乙酰化赖氨酸残基上增加相关。 H3和H4 PR2的发起人。由于核小体密度降低在基因的激活13，组蛋白乙酰化值正常化不变区域的组蛋白3抗体获得的信号。
图1 BTH诱导PR2的发起人在拟南芥组蛋白乙酰化 。植物均采用100μm的BTH或可湿性粉剂控制。 72h后，叶收集和染色质隔离。乙酰特异性抗体（如图所示）沉淀后得到的信号是标准化，以获得一种抗体降水不变域的组蛋白H3的信号。沉淀染色质，定量RT - qPCR的。数据是在BTH处理的情况下组蛋白修饰水平的标准化。
Discussion
在协议中最重要的步骤是DNA和组蛋白，叶片材料的类型和数量的交联，研磨材料，染色质的超声。对于这些问题的更详细的讨论，请参阅参考文献。 9日和10日。
超声和交联：
重要的是要破坏约400bp的片段，在超声染色。力竭超声破坏，破坏DNA和组蛋白的染色质，而超声不足会留下长期的染色质片段。这些影响的方法的特异性，因为从远端测试位点的组蛋白修饰，不能从本地修改歧视。超声效率是最好的测试，通过收集样品20μL前后超声，交联DNA和组蛋白，染色质隔离的DNA，并确定剪切DNA的琼脂糖凝胶电泳长度。应增加核糖核酸酶电泳前样品，染色质的准备，因为仍含有大量的RNA，在这个阶段净化零散的DNA的可视化，可能会干扰。样品是有用的染色质免疫沉淀，如果从非剪切染色质DNA大于10kbp，而从剪切染色质DNA形式的DNA大约400bp的最大信号强度一抹黑。
我们经常使用完整的叶片的染色质交联3％（V / V）的甲醛，但在大多数情况下有足够的1％（V / V）的甲醛可能。在我们的手中，低甲醛浓度允许超声时间较短和随之而来的PCR反应的背景信号。然而，甲醛不足，往往会造成PCR检测信号之间的独立实验重复性低。这可能是由于不足的渗透与甲醛在低浓度的叶。确保经常交换甲醛股票的复合趋于聚合，随着时间的推移。甲醛溶液是稳定的，只有约一个月，而这个时期是难以长期甲醇稳定。这是建议设立实验条件时，以测试不同的甲醛浓度。
植物材料和磨削的金额：
重要的是要在大量的缓冲渗透叶片材料的低量，以避免彼此的树叶粘。叶坚持结果往往不足的甲醛渗透。此外，过多的植物材料将阻塞毛孔的miracloth组织。研磨效率大大取决于使用迫击炮和杵完美契合。我们经常磨，用液氮冷却的杵和砂浆在没有额外的液态氮50秒，直到材料磨成细粉。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由德国科学基金会（DFG）和德国联邦政府和各州政府的卓越倡议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein-A-Agarose | Roche Group | 11 134 515 001 | depends on the antibody class |
| Protein-G-Agarose | Roche Group | 11 243 233 001 | depends on the antibody class |
| Anti-hyperacetyl-H4 | EMD Millipore | 06-946 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K5 | EMD Millipore | 07-327 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K8 | EMD Millipore | 07-328 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K12 | EMD Millipore | 07-595 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K16 | EMD Millipore | 07-329 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K18 | EMD Millipore | 07-354 | we used 1μL |
| Anti-acetyl-H3K9 | EMD Millipore | 07-352 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H3K14 | EMD Millipore | 07-353 | we used 1μL |
| Anti-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | we used 5μL |
| Anti-dimethyl-H3K4 | EMD Millipore | 07-030 | we used 5μL |
| Anti-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 -10μL |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | we used 1μL to check histone density |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
| Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
| Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche Group | 11836145001 |
References
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