Summary
Een betrouwbare en bruikbare benadering van de histon-modificaties op specifieke plantengenen te detecteren is beschreven. De aanpak combineert chromatine immunoprecipitatie (chip) en real-time kwantitatieve PCR. Het maakt de ontdekking van histon-modificaties op specifieke genen met een rol spelen in verschillende fysiologische processen.
Abstract
Chromatine structuur is belangrijk voor de regulatie van genexpressie in eukaryoten. In dit proces, chromatine remodeling, DNA methylatie, en covalente wijzigingen op de amino-terminale staarten van histonen H3 en H4 spelen een essentiële rol 1-2. H3 en H4 histon-modificaties omvatten methylatie van lysine en arginine, acetylering van lysine, en de fosforylatie van serine residuen 1-2. Deze wijzigingen zijn ofwel geassocieerd met gen-activering, repressie, of een gespannen toestand van het gen dat er meer snelle en robuuste activering van meningsuiting steunen na de waarneming van de juiste signalen (microbe-geassocieerde moleculaire patronen, licht, hormonen, etc.) 3-7.
Hier presenteren we een methode voor de betrouwbare en gevoelige detectie van specifieke chromatine modificaties op geselecteerde plantengenen. De techniek is gebaseerd op de verknoping van de (gewijzigde) histonen en DNA met formaldehyde 8,9, extractie en sonicatie van chromatine, chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met modificatie-specifieke antilichamen 9,10, de-verknoping van histon-DNA complexen, en gen-specifieke real-time kwantitatieve PCR. De aanpak is nuttig gebleken voor het opsporen van specifieke histon modificaties geassocieerd met C 4 fotosynthese in maïs 5,11 en systemische immuniteit in Arabidopsis 3.
Protocol
1. Verknoping van plantmateriaal
- Oogst 1-2g van Arabidopsis bladeren (6 tot 10cm rozet diameter) in een 50 ml plastic buisje en vul tot 40 ml met de verknoping buffer.
- Zorg ervoor dat bladeren blijven ondergedompeld, bijvoorbeeld door het vullen een op maat gemaakte filter spons recht boven buffer oppervlak. Plaats dan buizen in een exsiccator.
- Vacuüm infiltreren voor 10min. Aan elke buis 2,5 ml toe te voegen van 2M glycine tot verknoping te stoppen en omkeren buizen op gelijke spreiding van glycine rechtvaardigen.
- Vacuüm infiltreren voor een ander 5min en gooi vloeistof tijdens het oogsten bladeren op een zeef.
- Was de bladeren tweemaal met 1 liter water in een bekerglas, dan droge bladeren grondig met papieren handdoeken.
- Verzamel bladeren in een nieuwe plastic buis en vriezen in vloeibare stikstof. Bewaar vertrekt bij -80 ° C tot chromatine isolatie.
2. Isolatie van chromatine
- Bladeren werden grond met mortel en stamper die in vloeibare stikstof bewaard tot gebruik.
- Overdracht poeder om een 50-mL plastic buis en schorten 30 ml extractiebuffer # 1.
- Incubeer 15 minuten bij 4 ° C op een overhead shaker.
- Filtraat ophanging door middel van vier lagen van miracloth in een verse 50-mL plastic buis.
- Spin voor 20min bij 2.800 xg bij 4 ° C.
- Verwijder supernatant en schorten pellet met een kwast in 1 ml extractiebuffer # 2. Voeg eerst een klein volume van de buffer # 2, en dan pellet te schorten met een kwast, en voeg vervolgens de rest van de buffer.
- Overdracht vering om een 1,5 ml microfugebuis en spin voor 10min bij 12.000 xg bij 4 ° C.
- Ondertussen bereiden 2 ml-microfugebuizen buisjes met 1,5 ml extractiebuffer # 3.
- Verwijder het supernatans van de gesponnen buis (stap 2.7) en te schorten pellet in 300μL extractiebuffer # 3. Voeg eerst een klein volume van de buffer # 3, te schorsen pellet met een kwast, en voeg de resterende buffer.
- Voorzichtig pipet de gesuspendeerde pellet (stap 2.9) op de top van de 1,5 mL extractiebuffer # 3 bereid in stap 2.8. Zorg ervoor dat de twee fasen zal niet mengen. Spin voor 1 uur bij 16.000 xg bij 4 ° C.
- Verwijder supernatant en schorten chromatine pellet met een kwast in 300μL van ultrasoonapparaat buffer.
- Sonificeer chromatine met een sonotrode, of in een ultrasoon bad, om een DNA-grootte van ongeveer 400bp. Wanneer sonicating, zorg ervoor dat chromatine niet verwarmd boven ongeveer 30 ° C tot warmtegevoelige crosslinks te beschermen. De duur van ultrasoonapparaat moet experimenteel worden bepaald, omdat deze varieert aanzienlijk tussen verschillende ultrasoonapparaat apparaten. Voor begeleiding, zijn de instellingen voor twee verschillende apparaten op voorwaarde dat:
Voor ultrasoonapparaat met een Bandelin merk sonotrode bloot chromatine in 0,6 ml microfugebuis vijf keer tot 20 barst met instellingen 25% vermogen, cyclus = 50. Terwijl u dit doet, koele monster na iedere 20 ste barst in een ijsbad.
Voor ultrasoonapparaat met een Diagenode Bioruptor ultrasoonbad, vul bad met water en ijs en ultrasone trillingen tien keer gedurende 30 seconden in 1,5 ml microfuge tubes met het instellen van 'hoog'. Na elke 30 seconden, koele monsters voor nog eens 30 seconden.
- Spin gesoniceerd steekproef voor 5 min bij 16.000 g bij 4 ° C voor het neerslaan van onopgelost materiaal. Het supernatant kan direct gebruikt worden voor de immunoprecipitatie. Als alternatief kan monsters shock ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot verder gebruik.
3. Immunoprecipitatie
- Bereid 2-mL microfugebuizen buisjes met 40μL proteïne-A agarose en 1.8mL van antilichaam-binding buffer. Voeg 200μL van het chromatine voorbereiding (stap 2,13).
- Incubeer buizen voor 1 uur op een overhead shaker.
- Gooi proteïne-A-agarose parels en te gebruiken voor het supernatant immunoprecipitatie.
- Verwijderen van een 40μL-hoeveelheid aan chromatine concentratie ('input') te bepalen.
- Voeg 30μL proteïne-A agarose en de hoeveelheid van wijziging-specifieke antilichaam dat wordt aangegeven in de onderstaande tabel van specifieke reagentia en apparatuur om 400μL gesoniceerd chromatine schorsing.
- Incubeer 2.5u of 's nachts op een overhead-schudder bij 4 ° C.
- Spin down kralen voor 2min op 440 x g.
- Was kraal pellet met 900μL van elke wasbuffer (zie onderstaande lijst). Voor elke buffer, incubeer kralen in de buffer voor 10min op een overhead-schudder bij 4 ° C, dan draaien voor 2min op 440 xg, verwijder supernatant, en voeg de volgende buffer.
- Lage zout wasbuffer
- Hoog zoutgehalte wasbuffer
- LiCl wasbuffer
- TE wasbuffer
- Na de laatste wasbeurt, volledig te verwijderen alle resterende buffer.
4. De-verknoping van histonen en DNA, en zuivering van DNA neergeslagen
- Voeg 100μL van de-verknoping buffer naar de agarose pellet en de 40μl 'input' monster uit stap 3.4, mix voor 5min op een vortex-mixer, spin monsters, en incuBate bij 65 ° C gedurende de nacht.
- Zuiver DNA met een commerciële DNA-of PCR zuivering kit.
- Typisch 5μl van een 1:05 verdunning van de laatste kolom eluaat voldoende zijn om uit te voeren conventionele locus-specifieke real-time kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR).
5. Tabel van buffers
| Verknoping buffer | |
| Natriumbutyraat | 10 mM |
| Sucrose | 400mm |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 10 mM |
| β-mercapto-ethanol | 5mM |
| Formaldehyde | 3% (v / v) |
| Extractiebuffer # 1 | |
| Natriumbutyraat | 10 mM |
| Sucrose | 400mm |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 10 mM |
| β-mercapto-ethanol | 5mM |
| Compleet proteaseremmer | 1x |
| Extractiebuffer # 2 | |
| Natriumbutyraat | 10 mM |
| Sucrose | 250mm |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 10 mM |
| β-mercapto-ethanol | 5mM |
| MgCl 2 | 10 mM |
| Triton X-100 | 1% (w / v) |
| Compleet proteaseremmer | 1x |
| Extractiebuffer # 3 | |
| Natriumbutyraat | 10 mM |
| Sucrose | 1.7M |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 10 mM |
| β-mercapto-ethanol | 5mM |
| MgCl 2 | 2 mM |
| Triton X-100 | 0,15% (w / v) |
| Compleet proteaseremmer | 1x |
| Ultrasoonapparaat buffer | |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 25MM |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 5mM |
| SDS | 0,5% (w / v) |
| Compleet proteaseremmer | 1x |
| Antilichaambinding buffer | |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 50 mM |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 1 mM |
| NaCl | 150mm |
| Triton X-100 | 0,1% (w / v) |
| Lage zout wasbuffer | |
| NaCl | 150mm |
| SDS | 0,1% (w / v) |
| Triton X-100 | 1% (w / v) |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 2 mM |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 20MM |
| Hoog zoutgehalte wasbuffer | |
| NaCl | 500mm |
| SDS | 0,1% (w / v) |
| Triton X-100 | 1% (w / v) |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 2 mM |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 20MM |
| LiCl wasbuffer | |
| Lithiumchloride | 250mm |
| Nonidet-P40 | 1% (v / v) |
| Natrium desoxycholaat | 1% (w / v) |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 1 mM |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 20MM |
| TE wasbuffer | |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 10 mM |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 1 mM |
| Decrosslinking buffer | |
| Tris-HCl, pH 6,8 | 62,5 mm |
| NaCl | 200MM |
| SDS | 2% (w / v) |
| DTT | 10 mM |
6. Representatieve resultaten:
Expressie van de Arabidopsis thaliana PR2 verdediging gen dat codeert voor een β-1,3-glucanase met antimicrobiële activiteit 12, werd geïnduceerd door benzothiadiazole (BTH), een synthetisch analoog van het plantenhormoon salicylzuur 3. Figuur 1 toont aan dat activatie van PR2 expressie geassocieerd is met een toename van de acetylering van lysine residuen op histon H3 en H4 op de PR2 promotor. Sinds nucleosoom dichtheid afneemt tijdens gen activatie 13, werden histonacetylering waarden genormaliseerd voor het signaal verkregen met een antilichaam tegen een invariant gebied van histon 3.
Figuur 1 BTH induceert histonacetylering op de PR2 promotor in Arabidopsis. Planten werden behandeld met 100 urn BTH of een spuitpoeder controle. Na 72h, werden bladeren verzameld en chromatine werd geïsoleerd. Het signaal verkregen na precipitatie met acetylering-specifieke antilichamen (zoals aangegeven in de figuur) werd genormaliseerd om het signaal verkregen door precipitatie met een antilichaam tegen een invariant domein van histon H3. Neergeslagen chromatine werd gekwantificeerd door RT-qPCR. De gegevens zijn gestandaardiseerd voor histon-eiwitten niveaus in de afwezigheid van BTH behandeling.
Discussion
Meest kritische stappen in het protocol zijn de verknoping van DNA en histonen, de soort en hoeveelheid van bladmateriaal, slijpen van het materiaal, en de sonicatie van chromatine. Voor een meer gedetailleerde bespreking van deze onderwerpen, zie refs. 9 en 10.
Sonicatie en verknoping:
Het is belangrijk om chromatine te verstoren tijdens de sonicatie om fragmenten van ongeveer 400bp. Uitputtend sonicatie zal vernietigen chromatine door het verstoren van DNA en histonen, overwegende dat onvoldoende sonicatie zal verlaten lang chromatine fragmenten. Deze invloed op de specificiteit van de methode, omdat histonmodificaties distaal van de onderzochte locus kan niet worden gediscrimineerd van lokale aanpassingen. Sonicatie efficiency is het beste getest door het verzamelen van 20μL chromatine van de monsters voor en na sonicatie, de-crosslinking DNA en histonen, het isoleren van het DNA en het bepalen van de lengte van het geschoren DNA door agarose gelelektroforese. RNAse moet worden toegevoegd aan de monsters voor elektroforese, want het chromatine voorbereiding nog steeds bevat grote hoeveelheden RNA in dit stadium van zuivering die kunnen interfereren met de visualisatie van gefragmenteerd DNA. De monsters zijn handig voor het chromatine immunoprecipitatie als DNA van niet-geschoren chromatine langer is dan 10kbp, terwijl DNA van geknipte chromatine vormt een uitstrijkje met een maximale intensiteit van het signaal rond 400bp van DNA.
We routinematig gebruik van 3% (v / v) voor formaldehyde chromatine verknoping in intact laat, maar 1% (v / v) formaldehyde kan voldoende zijn in de meeste gevallen. In onze handen, een lage formaldehyde-concentraties zorgen voor kortere ultrasoonapparaat tijden en achtergrond signalen in consequent PCR-reacties. Echter, onvoldoende hoeveelheden formaldehyde resulteren vaak in lage reproduceerbaarheid van de PCR-signaal tussen onafhankelijke experimenten. Dit kan te wijten zijn aan onvoldoende penetratie van bladeren met formaldehyde bij lage concentraties. Zorg ervoor dat u uw formaldehyde voorraad vaak wisselen als de verbinding heeft de neiging om te polymeriseren met de tijd. Formaldehyde-oplossingen zijn stabiel slechts voor ongeveer een maand, en deze periode is nauwelijks verlengd met methanol stabilisatie. Het is aan te raden om verschillende concentraties formaldehyde-test bij het opzetten van experimentele omstandigheden.
Hoeveelheid plantaardig materiaal en slijpen:
Het is belangrijk om kleine hoeveelheden van bladmateriaal infiltreren in een groot volume van de buffer aan de bladeren aan elkaar plakken te voorkomen. Blad kleven resulteert vaak in onvoldoende infiltratie van formaldehyde. Bovendien zal te veel plantmateriaal blokkeren poriën van de miracloth weefsel. Het slijpen rendement is sterk afhankelijk van het gebruik van een mortier en een stamper met de perfecte pasvorm. We routinematig slijpen met een vloeibare stikstof gekoelde stamper en vijzel in de afwezigheid van extra vloeibare stikstof drie keer voor 50 seconden totdat het materiaal wordt gemalen tot een fijn poeder.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Stichting voor Wetenschappen (DFG) en de Excellence initiatief van de Duitse federale en deelstaatregeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein-A-Agarose | Roche Group | 11 134 515 001 | depends on the antibody class |
| Protein-G-Agarose | Roche Group | 11 243 233 001 | depends on the antibody class |
| Anti-hyperacetyl-H4 | EMD Millipore | 06-946 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K5 | EMD Millipore | 07-327 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K8 | EMD Millipore | 07-328 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K12 | EMD Millipore | 07-595 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K16 | EMD Millipore | 07-329 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K18 | EMD Millipore | 07-354 | we used 1μL |
| Anti-acetyl-H3K9 | EMD Millipore | 07-352 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H3K14 | EMD Millipore | 07-353 | we used 1μL |
| Anti-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | we used 5μL |
| Anti-dimethyl-H3K4 | EMD Millipore | 07-030 | we used 5μL |
| Anti-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 -10μL |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | we used 1μL to check histone density |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
| Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
| Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche Group | 11836145001 |
References
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO rep. 3, 224-229 (2002).
- Ruthenburg, A. J. Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic. 25, 15-30 (2007).
- Jaskiewicz, M. Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response. EMBO rep. 12, 50-55 (2011).
- Ng, D. W. Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter. Plant Cell. 18, 119-132 (2006).
- Offermann, S. Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize. Plant Physiol. 141, 1078-1088 (2006).
- Deng, W. Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis. Plant Physiol. 143, 1660-1668 (2007).
- Benhamed, M. Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression. Plant Cell. 18, 2893-2903 (2006).
- Bowler, C. Chromatin techniques for plant cells. Plant Journal. 39, 776-789 (2004).
- Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25, 99-104 (2000).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Meth. 3, 11-11 (2007).
- Danker, T. Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize. Plant J. 53, 465-474 (2008).
- Uknes, S. Acquired resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 4, 645-656 (1992).
- Workman, J. L. Nucleosome displacement in transcription. Genes Develop. 20, 2009-2017 (2006).
