Summary
En pålitlig och användbar metod för att upptäcka histon ändringar på specifik anläggning gener beskrivs. Den metod som kombinerar kromatin immunoprecipitation (chip) och i realtid av kvantitativ PCR. Den tillåter detektion av histon modifieringar på specifika gener med en roll i olika fysiologiska processer.
Abstract
Kromatinstrukturen är viktigt för reglering av genuttryck i eukaryoter. I denna process kromatin remodeling, DNA-metylering och kovalent ändringar på amino-terminal svansar av histoner H3 och H4 spela viktiga roller 1-2. H3 och H4 histon ändringar inkluderar metylering av lysin och arginin, acetylering av lysin och fosforyleringen av serin rester 1-2. Dessa ändringar är förknippade med antingen genaktivering, förtryck eller en primas tillstånd av genen som stöder snabbare och mer robust aktivering av uttryck efter uppfattning om lämpliga signaler (mikrob-associerade molekylära mönster, ljus, hormoner mm) 3-7.
Här presenterar vi en metod för tillförlitlig och känslig detektion av specifika kromatin ändringar på utvalda växter gener. Tekniken bygger på crosslinking av (modifierad) histoner och DNA med formaldehyd 8,9, utvinning och ultraljudsbehandling av kromatin, kromatin immunoprecipitation (chip) med modifikation antikroppar 9,10, de-crosslinking av histon-DNA-komplex, och genspecifika i realtid av kvantitativ PCR. Den metoden har visat sig användbara för att upptäcka specifika histon modifieringar i samband med C 4 fotosyntes i majs 5,11 och systemisk immunitet i Arabidopsis 3.
Protocol
1. Crosslinking av växtmaterial
- Harvest 1-2g i Arabidopsis blad (6 till 10cm rosett diameter) i en 50-ml plaströr och fyll upp till 40 ml med crosslinking buffert.
- Se till att bladen stannar nedsänkt, till exempel genom fyllning en skräddarsydd filter svamp precis ovanför buffert yta. Placera därefter rören i en exsickator.
- Vakuum infiltrera för 10min. Till varje rör lägga 2,5 ml 2M glycin för att stoppa crosslinking, och invertera rör för att motivera lika spridning av glycin.
- Vakuum infiltrera för en annan 5min och släng vätskan medan skörd blad på en sil.
- Tvätta lämnar två gånger med 1L vatten i en glasbägare, sedan torra löv ordentligt med hushållspapper.
- Samla löv i en fräsch plaströr och frysa i flytande kväve. Förvara bladen vid -80 ° C tills kromatin isolering.
2. Isolering av kromatin
- Löv marken med murbruk och pistill som hölls i flytande kväve tills de ska användas.
- Överför pulver till en 50-mL plaströr och suspendera i 30 ml extraktionsbuffert # 1.
- Inkubera i 15 min vid 4 ° C på en overhead shaker.
- Filtratet fjädring genom fyra lager av miracloth i en ny 50-mL plaströr.
- Spin för 20min vid 2800 xg vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och suspendera pelleten, med en pensel i 1 mL extraktionsbuffert # 2. Lägg först till en liten mängd buffert # 2 och sedan avbryta pelleten, med en pensel och sedan lägga resten av bufferten.
- Överför suspensionen till ett 1,5 mL mikrofugrör och snurra för 10min på 12.000 xg vid 4 ° C.
- Under tiden förbereder 2ml-mikrofugrör provrör innehållande 1,5 mL extraktionsbuffert # 3.
- Avlägsna supernatanten från spunnet röret (steg 2,7) och suspendera pelleten i 300μL extraktionsbuffert # 3. Lägg först till en liten mängd buffert # 3, upphäva pelleten, med en pensel och sedan lägga till de återstående buffert.
- Försiktigt pipettera den avstängda pellet (steg 2,9) på toppen av 1,5 mL extraktionsbuffert # 3 som bereddes i steg 2,8. Se till att de två faserna kommer inte att blanda. Spin för 1h på 16.000 xg vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och suspendera kromatin pelleten, med en pensel i 300μL av sonication buffert.
- Sonikera kromatin med en sonotrode eller i ett ultraljudsbad, till en DNA-storlek på cirka 400bp. När sonicating, se till kromatin inte kommer värmas över 30 ° C för att skydda värmekänsliga antipyridinantikropp. Tiden för ultraljudsbehandling måste bestämmas experimentellt, eftersom det varierar kraftigt mellan olika sonication enheter. Som vägledning finns inställningar för två olika enheter ges:
För sonication med en Bandelin varumärke sonotrode utsätta kromatin i 0,6 ml mikrofugrör fem gånger till 20 skurar med inställningar 25% effekt, cykel = 50. Medan du gör det, sval prov efter var 20: e brister i ett isbad.
För sonication med en Diagenode Bioruptor badet, fyll badkaret med vatten och is och Sonikera tio gånger under 30 sekunder i 1,5 mL mikrofugrör rör med inställningen "hög". Efter varje 30 sekunder, svalt prover i ytterligare 30 sekunder.
- Spin sonicated urvalet för 5min på 16 tusen g vid 4 ° C för att fälla upplöst material. Supernatanten kan direkt användas för immunoprecipitation. Alternativt kan proverna chock frysas i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C tills vidare användning.
3. Immunoprecipitation
- Förbered 2-ml mikrofugrör provrör innehållande 40μL protein-A agarose och 1.8mL av antikroppar bindande buffert. Tillsätt 200μL av kromatin beredningen (steg 2,13).
- Inkubera rören för 1h på en overhead shaker.
- Kasta protein-A agaros pärlor och använda supernatanten för immunoprecipitation.
- Ta bort ett 40μL-alikvot att avgöra kromatin koncentration ('input').
- Lägg 30μL protein-A agarose och mängden modifieringen-specifik antikropp som anges i tabellen nedan för specifika reagenser och utrustning för att 400μL sonicated kromatin suspension.
- Inkubera 2.5h eller över natten på en overhead shaker vid 4 ° C.
- Spinn ner pärlor för 2min vid 440 x g.
- Tvätta pärla pellets med 900μL av varje tvättbuffert (se nedan lista). För varje buffert, inkubera pärlor i bufferten för 10min på en overhead shaker vid 4 ° C, snurra sedan för 2min vid 440 xg, kassera supernatanten och lägga till nästa buffert.
- Låg salt tvättbuffert
- Hög salt tvättbuffert
- LiCl tvättbuffert
- TE tvättbuffert
- Efter den sista tvätten, helt ta bort alla återstående buffert.
4. De-crosslinking av histoner och DNA, och rening av utfällda DNA
- Tillsätt 100μL av de-crosslinking bufferten till agarosen pellet och 40μl "input" prov från steg 3,4, mix för 5min på en vortexblandare, prover spinn, och incuBATE vid 65 ° C över natten.
- Rena DNA med en kommersiell DNA-eller PCR-rening kit.
- Normalt 5μl av en 1:05 spädning av den sista kolumnen eluatet är tillräckliga för att utföra traditionella locus-specifika i realtid av kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR).
5. Tabell över buffertar
| Crosslinking buffert | |
| Natrium butyrat | 10 mM |
| Sackaros | 400mm |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 10 mM |
| β-Mercaptoethanol | 5mm |
| Formaldehyd | 3% (v / v) |
| Extraktionsbuffert # 1 | |
| Natrium butyrat | 10 mM |
| Sackaros | 400mm |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 10 mM |
| β-Mercaptoethanol | 5mm |
| Komplett Proteashämmare | 1x |
| Extraktionsbuffert # 2 | |
| Natrium butyrat | 10 mM |
| Sackaros | 250mm |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 10 mM |
| β-Mercaptoethanol | 5mm |
| MgCl 2 | 10 mM |
| Triton X-100 | 1% (w / v) |
| Komplett Proteashämmare | 1x |
| Extraktionsbuffert # 3 | |
| Natrium butyrat | 10 mM |
| Sackaros | 1.7M |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 10 mM |
| β-Mercaptoethanol | 5mm |
| MgCl 2 | 2mm |
| Triton X-100 | 0,15% (w / v) |
| Komplett Proteashämmare | 1x |
| Sonication buffert | |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 25MM |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 5mm |
| SDS | 0,5% (w / v) |
| Komplett Proteashämmare | 1x |
| Antikroppsbindning buffert | |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 50 mM |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 1mm |
| NaCl | 150mm |
| Triton X-100 | 0,1% (w / v) |
| Låg salt tvättbuffert | |
| NaCl | 150mm |
| SDS | 0,1% (w / v) |
| Triton X-100 | 1% (w / v) |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 2mm |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 20MM |
| Hög salt tvättbuffert | |
| NaCl | 500mm |
| SDS | 0,1% (w / v) |
| Triton X-100 | 1% (w / v) |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 2mm |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 20MM |
| LiCl tvättbuffert | |
| Litiumklorid | 250mm |
| Nonidet-P40 | 1% (v / v) |
| Natrium desoxycholate | 1% (w / v) |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 1mm |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 20MM |
| TE tvättbuffert | |
| EDTA-NaOH, pH 8,0 | 10 mM |
| Tris-HCl, pH 8,0 | 1mm |
| Decrosslinking buffert | |
| Tris-HCl, pH 6,8 | 62.5mM |
| NaCl | 200mm |
| SDS | 2% (w / v) |
| DTT | 10 mM |
6. Representativa resultat:
Redovisning av Arabidopsis thaliana PR2 försvar som kodar för en β-1,3-glukanas med antimikrobiell aktivitet 12, var en följd av benzothiadiazole (BTH), en syntetisk analog av anläggningen hormonet salicylsyra 3. Figur 1 visar att aktivering av PR2 uttryck är förknippad med en ökning av acetylering av lysinrester på histon H3 och H4 på PR2 arrangören. Sedan nukleosomen densitet minskar under genaktivering 13, var histon acetylering värdena normaliserats för den signal som erhålls med en antikropp mot ett invariant region histon 3.
Figur 1 BTH inducerar histon acetylering på PR2 promotor i Arabidopsis. Växter behandlades med 100μM BTH eller en slampulver kontroll. Efter 72h var löv samlas in och kromatin var isolerad. Den signal som erhålls efter fällning med acetylering-specifika antikroppar (som anges i figuren) var normaliserad till den signal som erhålls genom fällning med en antikropp mot ett invariant domän histon H3. Utfällda kromatin kvantifierades med RT-qPCR. Data är standardiserad för histon modifieringar i avsaknad av BTH behandling.
Discussion
Mest kritiska stegen i protokollet är crosslinking av DNA och histoner, typ och mängd blad material, slipning av materialet, och sonication av kromatin. För en mer detaljerad diskussion om dessa frågor, se refs. 9 och 10.
Sonication och crosslinking:
Det är viktigt att störa kromatin under sonication till fragment av ca 400bp. Uttömmande sonication kommer att förstöra kromatin genom att störa DNA och histoner, medan otillräcklig ultraljudsbehandling lämnar långa kromatin fragment. Dessa påverkar särdragen i den metod, eftersom histon ändringar distala från den provade locus inte kan diskrimineras från lokala ändringar. Sonication verkningsgrad är bäst testas genom att samla 20μL kromatin från prover före och efter ultraljudsbehandling, de-crosslinking DNA och histoner, isolera DNA och bestämma längden på klippt DNA med agarosgelelektrofores. RNAse bör läggas till de prover innan elektrofores, eftersom kromatinet preparatet innehåller fortfarande stora mängder RNA i detta skede av rening som kan störa visualiseringen av fragmenterad DNA. Proverna är användbara för kromatin immunoprecipitation om DNA från icke klippt-kromatin är längre än 10kbp, medan DNA från klippt kromatin bildar ett utstryk med maximal signalstyrka runt 400bp av DNA.
Vi använder rutinmässigt 3% (v / v) formaldehyd för kromatin crosslinking i intakta blad, men 1% (v / v) formaldehyd vara tillräckligt i de flesta fall. I våra händer, låga formaldehyd halter möjliggöra kortare sonication tider och signaler bakgrund därav PCR-reaktioner. Men inte tillräckligt mängder av formaldehyd ofta resulterar i låg reproducerbarhet av PCR-signalen mellan oberoende försök. Det kan bero på otillräcklig penetration av blad med formaldehyd vid låga koncentrationer. Se till att byta din formaldehyd lager ofta som föreningen tenderar att polymerisera med tiden. Formaldehyd lösningar är stabila bara för cirka en månad, och denna period är knappast förlängas med metanol stabilisering. Det rekommenderas att testa olika formaldehyd koncentrationer när du ställer in experimentella förhållanden.
Mängden växtmaterial och slipning:
Det är viktigt att infiltrera små mängder av blad material i en stor buffert för att undvika att löv att hålla sig till varandra. Leaf fastnar ofta leder till otillräckliga infiltration av formaldehyd. Dessutom kommer för mycket växtmaterial blockera porerna i miracloth vävnad. Malningen effektivitet beror mycket på att använda en mortel med perfekt passform. Vi slipar rutinmässigt med ett flytande kväve-kyld mortel i avsaknad av ytterligare flytande kväve tre gånger under 50 sekunder tills materialet mals till ett fint pulver.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av det tyska Science Foundation (DFG) och Excellence initiativ av den tyska federala och statliga regeringar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protein-A-Agarose | Roche Group | 11 134 515 001 | depends on the antibody class |
| Protein-G-Agarose | Roche Group | 11 243 233 001 | depends on the antibody class |
| Anti-hyperacetyl-H4 | EMD Millipore | 06-946 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K5 | EMD Millipore | 07-327 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K8 | EMD Millipore | 07-328 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K12 | EMD Millipore | 07-595 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K16 | EMD Millipore | 07-329 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H4K18 | EMD Millipore | 07-354 | we used 1μL |
| Anti-acetyl-H3K9 | EMD Millipore | 07-352 | we used 5μL |
| Anti-acetyl-H3K14 | EMD Millipore | 07-353 | we used 1μL |
| Anti-trimethyl-H3K4 | Diagenode | pAB-003-50 | we used 5μL |
| Anti-dimethyl-H3K4 | EMD Millipore | 07-030 | we used 5μL |
| Anti-monomethyl-H3K4 | Abcam | ab8895 | 2,5 -10μL |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | we used 1μL to check histone density |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 TO | |
| Sonotrode MS72 | Bandelin | ||
| Miracloth | Calbiochem | 475855 | |
| Complete Protease Inhibitor | Roche Group | 11836145001 |
References
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO rep. 3, 224-229 (2002).
- Ruthenburg, A. J. Methylation of lysine 4 on histone H3: intricacy of writing and reading a single epigenetic. 25, 15-30 (2007).
- Jaskiewicz, M. Chromatin modification acts as a memory for systemic acquired resistance in the plant stress response. EMBO rep. 12, 50-55 (2011).
- Ng, D. W. Ordered histone modifications are associated with transcriptional poising and activation of the phaseolin promoter. Plant Cell. 18, 119-132 (2006).
- Offermann, S. Illumination is necessary and sufficient to induce histone acetylation independent of transcriptional activity at the C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase promoter in maize. Plant Physiol. 141, 1078-1088 (2006).
- Deng, W. Involvement of the histone acetyltransferase AtHAC1 in the regulation of flowering time via repression of FLOWERING LOCUS C in Arabidopsis. Plant Physiol. 143, 1660-1668 (2007).
- Benhamed, M. Arabidopsis GCN5, HD1, and TAF1/HAF2 interact to regulate histone acetylation required for light-responsive gene expression. Plant Cell. 18, 2893-2903 (2006).
- Bowler, C. Chromatin techniques for plant cells. Plant Journal. 39, 776-789 (2004).
- Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde decrosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trends Biochem. Sci. 25, 99-104 (2000).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Meth. 3, 11-11 (2007).
- Danker, T. Developmental information but not promoter activity controls the methylation state of histone H3 lysine 4 on two photosynthetic genes in maize. Plant J. 53, 465-474 (2008).
- Uknes, S. Acquired resistance in Arabidopsis. Plant Cell. 4, 645-656 (1992).
- Workman, J. L. Nucleosome displacement in transcription. Genes Develop. 20, 2009-2017 (2006).
