Summary
Este relatório fornece uma descrição detalhada da metodologia e os resultados do mapeamento endocárdico e epicárdico simultâneos óptico de excitação elétrica no átrio esquerdo intacto de um coração de ovelha Langendorff-perfundidos durante o alongamento induzida por fibrilação atrial.
Abstract
Fibrilação atrial (FA) é uma arritmia cardíaca complexa, com alta morbidade e mortalidade 1,2. É o mais comum distúrbio do ritmo cardíaco mantido visto na prática clínica e sua prevalência é esperado um aumento nos próximos anos. 3 Aumento da pressão intra-atrial e dilatação ter sido reconhecido por muito tempo para levar a AF, 1,4 o que evidencia a relevância da utilização de modelos animais para estudar e esticar AF dinâmica. Compreender os mecanismos subjacentes AF requer visualização das ondas elétrica cardíaca com resolução espacial e temporal. Enquanto a alta resolução temporal pode ser obtida através do mapeamento elétrica convencional, tradicionalmente usado em humanos estudos eletrofisiológicos, o pequeno número de eletrodos intra-atrial que podem ser usados simultaneamente limita a resolução espacial e impede qualquer acompanhamento detalhado das ondas elétricas durante a arritmia. A introdução de mapeamento óptico no início dos anos 90 a caracterização de campo amplo de atividade fibrilatório habilitado, juntamente com sub-milímetro resolução espacial em modelos animais 5,6 e levou à identificação de padrões de ondas girando rapidamente elétrica (rotores) como as fontes do fibrilatório atividade que pode ocorrer nos ventrículos ou aurículas. 7-9 Usando o tempo e combinada no domínio da freqüência análises de mapeamento óptico, é possível demonstrar locais discretos de atividade de alta frequência periódica durante AF, juntamente com gradientes de frequência entre átrio esquerdo e direito . A região com a mais rápida rotores ativa na maior frequência e unidades da arritmia em geral. 10,11 As ondas que emanam rotor como interagir com os obstáculos ou anatômica ou funcional em seu caminho, resultando no fenômeno da condução fibrilatório. 12 Mapeamento da superfície endocárdica do o átrio esquerdo posterior (PLA), permite o rastreamento de AF onda dinâmica na região com a maior freqüência de rotor. Importante, o PLA é a região onde intracavitária cateter procedimentos baseados ablativos são mais bem sucedidos AF terminando em pacientes, 13, que ressalta a relevância do estudo AF dinâmica do interior do átrio esquerdo. Descrevemos aqui um modelo de ovelhas de estiramento agudo induzido por AF, que se assemelha a algumas das características do ser humano fibrilação atrial paroxística. Mapeamento epicárdico no átrio esquerdo é complementada com mapeamento endocárdico do PLA usando um canal dual-borescope rígida c-montado em uma câmera CCD, que representa a abordagem mais direta de visualizar os padrões de ativação na região mais relevantes para a manutenção da FA.
Protocol
1. Remoção do coração e perfusão Langendorff
Ovelhas pesando 35-40 kg são anestesiados com propofol 4-6 mg / Kg e 60-100 mg / Kg de pentobarbital sódico. Corações são removidos através de toracotomia e conectado a um sistema de perfusão Langendorff com circulação oxigenada (95% O2, 5% CO2) solução de Tyrode a uma taxa constante fluxo de 240-270 ml / min, pH 7,4 e 35,5-37,5 ° C. Composição do Tyrode (em mM) é: NaCl 130, KCl 4.0, MgCl2 1, CaCl2 1,8, NaHCO3 24, NaH2PO4 1.2, Glicose 5,6 e albumina 0,04 g / L. Blebbistatin 10 mM (Enzo Life Science International, Inc. Plymouth Meeting, PA, EUA) é usado para reduzir a força contrátil.
2. Estiramento induzida fibrilação atrial no coração ovelhas Langendorff-perfundidos
O isolado, coração de perfusão coronariana submetido a uma punção trans-septal atrial para habilitar empatou pressão intracavitária em ambos os átrios. Todos os orifícios das veias são então selados, com exceção da veia cava inferior, que é canulada e conectada a um sensor digital (Biopac Sistemas transdutor-TSD104A; Biopac Systems, Inc., Goleta, CA, EUA) e uma cânula cuja saída open-ended altura acima do átrios controla a pressão intra-atrial. A pressão é então aumentado para 12 cm H 2 O, o que leva a um aumento de ~ 30% em relação ao volume atrial o volume de 6 cm H 2 O. A pressão é mantida estável durante todo o experimento. Antes de selar as veias cateteres-eletrodos tetrapolar (Torq, Medtronic Inc. / Minneapolis / MN / EUA) são colocados em cada uma das veias pulmonares para gravar sinais bipolar dos dois eletrodos distal (taxa de amostragem, 1,0 kHz) usando um amplificador de Sistemas Biopac (DA100C; Biopac Systems, Inc., Goleta, CA, EUA). Mais dois eletrodos custum-made bipolar são colocados no teto do apêndice atrial esquerdo (AAE) e no topo da aurícula direita.
3. Mapeamento óptico configurado
- Mapeamento epicárdico do apêndice atrial esquerdo. A injeção em bolus de 5 a 10 ml Di-4-ANEPPS (10 mg / mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e um período de carga de 10 min são necessárias para obter fluorescência sensíveis à voltagem sobre a excitação do laser (532 nm) da superfície epicárdica. A fluorescência emitida é então transmitida através de uma longa 600 nm e filtro passa projetada LittleJoe CCD da câmera de vídeo (80x80 pixels, SciMeasure Analytical Systems, Inc. Decatur, GA, EUA) e adquiridas a uma taxa de 800 quadros por segundo (veja representação esquemática na Figura 1A). Cinco segundos filmes são obtidas em intervalos de 2 min durante AF. A área da superfície mapeada epicárdica é ~ 14 cm 2.
- Mapeamento endocárdico óptica do PLA do coração intacto. Um segundo LittleJoe câmera CCD (80x80 pixels) é sincronizada com a câmera do epicárdio. A 10 milímetros de diâmetro borescope canal dual-rígida (VIT Everest, Inc. Flanders, NJ, EUA) com um campo de 90 graus de vista é introduzido através da parede anterior do ventrículo esquerdo, através da válvula mitral e incidiu sobre a superfície do endocárdio do PLA. A área mapeada opticamente na PLA é de aproximadamente 4 cm 2, que permite visualizar as quatro veias pulmonares e do pacote de septo atrial-pulmonar (Figura 1A, B). A borescope é c-montados para a câmera CCD por meio de um adaptador de ocular feito por encomenda. A luz do laser 532 nm é então entregue ao canal de excitação do borescope através de um líquido luz-guia (0,2 no core).
4. Protocolo de fibrilação atrial
Sob estiramento atrial contínua AF é induzida através de pacing explosão (12 Hz, 5 ms pulsos, limiar 2x diastólica) por um eletrodo de marcapasso localizado no topo da LAA. AF é autorizado a continuar por 50 minutos e 5-sec filmes ópticos são adquiridos em intervalos de dois minutos. Gravações bipolares são coletados de forma contínua. Aquisição dos filmes ópticos triggers aquisição simultânea de 5-sec segmentos das gravações bipolar.
5. Análise de freqüência
Análise de freqüência permite a identificação de regiões com alta taxa de activação durante a AF, juntamente com gradientes de frequência entre átrio esquerdo e direito. Dominante freqüência (DF) mapas são obtidos a partir de cada filme óptico depois de aplicar um algoritmo de transformação rápida de Fourier (FFT) ao sinal de fluorescência de séries temporais registrados a cada pixel. 7 FFT também é aplicado para os 5 sinais segunda bipolar (High-pass filtrada em 3 Hz e passa-baixa filtrada a 35 Hz) sincronizado com os filmes ópticos.
6. Atrial dinâmica fibrilação
- Geração de mapas de fase. Análise da dinâmica AF aproveita filmes fase gerada através de transformação de Hilbert. 14 Resumidamente, a fase instantânea do potencial de ação registrado em cada pixel é determinada pela transformação do original de séries temporais de sinais de tal forma que cada componente espectral é desviado por seu ciclo de trimestre correspondente 15. Afterwards, a fase instantânea do sinal é obtida a partir da tangente inversa da razão entre o sinal transformado do sinal original. O ângulo de fase, com valores entre-π e π radianos é representado como um esquema de cor contínua para construir um mapa de fase, em que a mudança de fase espacial contínua reflete o processo de repolarização excitação, e recuperação. 14
- Caracterização dos padrões de ativação. Várias classes de padrões de ativação podem ser identificadas usando filmes de fase (Figura 2), incluindo o seguinte:
- Um rotor é identificada pela presença de todas as fases convergindo para um ponto de singularidade que durou mais de uma rotação (Figura 2A).
- A descoberta é definida como uma frente de onda que aparecem no campo de visão e propagar para fora (Figura 2B) em um padrão meta-like.
- Espaço-temporalmente organizada ondas periódicas são definidos como um mínimo de quatro seqüencial ondas periódicas emergentes do mesmo local no campo de visão, com sentido semelhantes e inter-onda intervalo (Figura 2C).
Quantificação ainda permite a correlação espacial dos domínios com maior freqüência o padrão mais comum de ativação obtida por aquela região em particular. Este último destaca o papel crucial do mapeamento da superfície endocárdica do PLA, uma vez que geralmente representa a região onde os domínios maior freqüência estão localizados durante AF aguda.
7. Resultados representativos:
Dominante freqüência (DF) gradientes de PLA para LAA e RAA estão presentes durante aguda induzida por estiramento AF. A região mais alta DF está localizada tanto em ou perto de uma das veias pulmonares ou em algum lugar do PLA. 11 Um representante AF episódio é mostrado na Figura 3, no qual a maior DF está localizada no PLA (direito inferior da veia pulmonar). Os resultados apóiam a presença de fontes de alta freqüência na condução PLA AF consistente com a da esquerda para a direita gradientes DF observado durante procedimentos de ablação na fibrilação atrial paroxística humana. 16
Quantificação dos padrões de ativação usando filmes mapa de fase mostra que o maior número de rotores é encontrado no PLA e na junção entre o PLA eo LAA. 8 Ocasionalmente, é possível identificar de longa duração rotores, cujo centro de rotação (ponto de singularidade) localiza com o domínio de freqüência mais alta. 10 Como o tecido atrial representa uma estrutura tridimensional, identificando os rotores na superfície mapeada endocárdica do PLA sugere que o centro de rotação dos rotores (filamento) é eventualmente perpendicular à superfície da área de mapeamento . A Figura 4 mostra como um rotor gravado a partir do endocárdio do PLA com condução fibrilatório simultânea para o LAA, que também se correlaciona com um gradiente de freqüência entre o PLA eo LAA (9 e 6,4 Hz, respectivamente). O número de rotores é consistentemente maior no PLA que o LAA, o que sugere um papel essencial de reentrada sobre o PLA para manter a arritmia neste modelo.
Globalmente, os resultados suportam a teoria de que os rotores estável e rápido no átrio esquerdo pode conduzir aguda induzida por estiramento AF e as ondas que emanam submeter complexos, padrões bloco espacialmente distribuídos de condução, como eles cabeça em direção ao átrio direito, manifestando-se como condução fibrilatório e diminuindo progressivamente dominante freqüência.
Figura 1. Representação esquemática do conjunto experimental. A: A borescope rígida é introduzido através da parede anterior do ventrículo esquerdo e do orifício da válvula mitral e incidiu sobre a superfície do endocárdio do átrio esquerdo posterior (PLA). Uma câmera CCD é acoplado ao borescope e iluminação a laser é fornecida através de um guia a laser líquido conectado à parte inferior do borescope. Mapeamento epicárdico é executada no LAA. Eletrodos bipolares são colocados no átrio direito e teto do átrio esquerdo. Sinais adicionais bipolar são obtidos a partir das veias pulmonares. B: Vista lateral do átrio esquerdo após a abertura da parede lateral para fins de ilustração. A ponta do borescope ilumina a superfície endocárdica do PLA. Um eletrodo bipolar está localizado no teto do átrio esquerdo. LAA: left apêndice atrial. LV: ventrículo esquerdo. RA: átrio direito. VD: ventrículo direito.
Figura 2. Diferentes padrões de ativação identificados após a geração de filmes de fase. A: tiros snap seqüencial do apêndice atrial esquerdo (AAE) mostram o giro de um rotor em torno do seu centro de rotação (ponto de singularidade). Da esquerda para a direita, uma rotação completa seja concluída. B: Uma amostra padrão de ativação avanço sobre o LAA. A onda aparece na uppor canto direito do campo de visão e se propaga para fora. C: Quatro espaço-temporalmente organizada ondas periódicas (A 0, 182, 352 e 512 ms, respectivamente) proveniente da região PLA para o LAA. Isócronas são plotadas em intervalos de 10 ms. Fundo, a chave para as diferentes fases do potencial de ação é um código de cores.
Figura 3. Identificação das regiões com maior freqüência a atividade durante o estiramento aguda induzida por AF em um coração de ovelha Langendorff-perfundidos isolados. A: vista anatômico do apêndice atrial esquerdo (AAE), aurícula direita (RAA) e do átrio esquerdo posterior (PLA). PLA imagem é uma visão endoscópica da região mapeada com as quatro veias pulmonares (VPs). B: DF mapas obtidos pelo mapeamento óptico na LAA e PLA. Valor da freqüência na RAA foi obtida a partir eletrogramas bipolares. A região de maior freqüência está localizado no PLA. C: Representante espectros de potência, em que o DF máximo corresponde a 12,4 Hz na região PLA dos PVs direita. VPSE: veia pulmonar superior esquerda. VPIE: veia pulmonar inferior esquerda. VPSD: veia pulmonar superior direita. VPID: veia pulmonar direita inferior. Reproduzido da referência 11 (David Filgueiras Rama e José Jalife. Mecanismos subjacentes Fibrilação Atrial. Em Ciência Básica para Electrophysiologist Clínica, vol. 3 (ed. Charles Antzelevitch) 141-156 (SAUNDERS, 2011).
Figura 4. Simultaneousphase mapas (A, B) e mapas de freqüência dominante (C) a partir do átrio esquerdo posterior (PLA) e apêndice atrial esquerdo (AAE). A: tiros snap seqüencial a partir do PLA mostrando um rotor ea deriva do seu ponto de singularidade. B: tiros fase simultânea pressão da LAA. Padrões de ativação mostram ondas de propagação compatível com a condução fibrilatório. Pontos de singularidade também estão presentes em correlação com wavebreaks na região de condução fibrilatório. (Veja também o vídeo 4) C: simultânea mapas freqüência dominante do PLA e do LAA. O mais rápido região está localizada no PLA (9 Hz), que se correlaciona com a presença de um rotor na análise mapa de fase. A maior freqüência na LAA é de 6 Hz, que se correlaciona com condução fibrilatório. No lado direito do painel C, único pixel de ativações óptica de PLA e LAA são mostrados.
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Discussion
As características do trecho aguda induzida por AF no coração ovelhas isoladas lembram algumas das propriedades dos recursos humanos fibrilação atrial paroxística. Um aumento agudo na pressão intra-atrial no coração de ovelha permite a manutenção da AF por longos períodos de tempo, semelhante a um maior risco de AF observada em pacientes com dilatação atrial. A presença de um gradiente da esquerda para a direita no DF ovelhas átrios também é semelhante aos registrados em humanos estudos eletrofisiológicos. 16 Portanto, a compreensão do mecanismo de sustentação AF neste modelo aguda pode melhorar as estratégias terapêuticas atualmente usado em humanos fibrilação atrial paroxística. Algumas das limitações da abordagem atual são: primeiro, a dificuldade de reproduzir o efeito do sistema nervoso autônomo sobre a fibrilação em corações isolados, o que impede a extrapolação dos resultados para situações in vivo. E segundo, o modelo se concentra em esticar aguda induzida por AF, e, portanto, as conclusões não devem ser alargadas a corações estruturalmente remodelado, no qual a fibrose e alterações nas propriedades elétrica pode afetar padrões de ativação do PLA e LAA. Por último, deve-se notar que devido às limitações ópticas, bem como a toxicidade dos corantes sensíveis à tensão e movimento desacoplamento compostos, técnicas de mapeamento óptico não são actualmente possível em indivíduos vivos.
Não obstante, o uso de mapeamento óptico e, especificamente, o mapeamento endocárdico do PLA, como demonstrado neste protocolo avanços nossa compreensão mecanicista da AF, identificando o maior número de rotores nos domínios mais rápido freqüência. O último sugerem que a reentrada pode ser essencial para sustentar a arritmia. Assim, diferentes estratégias farmacológicas foco na terminação de reentrada podem ser estudadas usando este modelo, o que o torna adequado para estudos relevantes translacional.
Avanços tecnológicos na abordagem de mapeamento óptico estão continuamente a ser procurada. Embora a visão de campo amplo e resolução espacial e temporal alta obtidas com o mapeamento óptico permite a identificação de longa duração de rotores na superfície 2D mapeada, muitas vezes os rotores afastar-se do campo de visão. Assim, uma abordagem de mapeamento mais panorâmica óptica permitiria um melhor acompanhamento dos rotores deriva e da arritmia em geral. Novos corantes que fornecem penetração mais profunda dos sinais e novas análises matemáticas também pode permitir que os rotores de rastreamento e seus filamentos no interior da estrutura 3D da parede PLA. Este último também permitiria um melhor entendimento dos padrões de ativações anteriormente descrito como avanços superfície, o que pode representar a atividade reentrante intramural. Melhorias adicionais sendo perseguido incluem: toxicidade reduzida dos corantes sensíveis à tensão; sondas ópticas para mais parâmetros fisiológicos, como a concentração de cálcio intracelular; compostos melhorado e técnicas para a redução de movimento.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Apoiado em parte pelo NHLBI Grants P01-P01-HL039707 e HL087226 ea Fundação Leducq (JJ e OB), por uma Sociedade Espanhola de Cardiologia Fellowship, Fundación Pedro Barrie de la Maza e Alfonso Martín Escudero Fundación (DFR), pela Fédération Française de cardiologie (RPM), por um coração Award comunhão Rhythm Society, The Fellowship of Japan Heart Foundation / A Sociedade Japonesa de Eletrocardiologia (MY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Propofol | Abbott Laboratories | 5206-04-03 | |
| Pentobarbital | Lundbeck Inc | NDC 67386-501-55 | |
| Introducer 18 Gauge | Terumo Medical Corp. | SS*FF1832 | |
| Cuffed endotracheal tube (9 mm) | DRE Veterinary | #9440 | |
| Fiber Optic Laryngoscope Case | DRE Veterinary | #991 | |
| Fiber Optic Blade | DRE Veterinary | #984 | |
| Operating Scissors | DRE Veterinary | #9702#1944 | |
| Scalpel Handle #3 Solid 4" | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9843 | |
| Sterile Scalpel Blades | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9801-10 | |
| Ventilation bag | Westmed | 562013 | |
| Sims Scissors Curved Sharp/Blunt | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-7035 | |
| Tissue Forceps (×2) | DRE Veterinary | #1895 | |
| KANTROWITZ Thoracic Forceps, 11" | Biomedical Research Instruments | 34-1980 | |
| Finochietto Large Chest Spreader | Kapp Surgical Instrument Inc. | KS-7301 | |
| Thoracotomy shears | Rostfrei Solingen | ||
| Plastic tray | Nalge Nunc international | Fischer | |
| Bonn Scissors (×2) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5840SC | |
| Surgical silk | Fisher Scientific | 50-900-04214 | |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5130 | |
| Tetrapolar electrode catheters (Torq) (×4) | Medtronic Inc. | 05580SP | |
| Digital sensor. Biopac Systems transducer | Biopac Systems, Inc. | RX104A | |
| Biopac Systems amplifier | Biopac Systems, Inc. | DA-100C | |
| Di-4-ANEPPS | Sigma-Aldrich | D8604-5mg | |
| Blebbistatin | Enzo Life Sciences | BML-E1315-0025 | |
| LittleJ– CCD video camera(×2) | SciMeasure Analytical Systems, Inc. | ||
| Dual-channel rigid borescope | Everest VIT, Inc. | R10-25-0-90 | |
| Perfusion pumps (×2) | Cole-Parmer | GK-77920-30 | |
| Temperature probe | Cole-Parmer | R-08491-02 | |
| pH meter | Fisher Scientific | 01-913-806 | |
| Digital temperature gauge | Cole-Parmer | GK89000-10 | |
| Oxygenator filters | Sorin | 05318 | |
| Silicon perfusion tubes (L/S 15) | Masterflex (Cole Palmer) | 96410-15 | |
| Laser light guides (×6) | Oriel Corp. | 77536 | |
| Liquid light-guide (0.2 in core) | Newport Corp. | 77556 | |
| Laser generator (1 watt) (×1) | Shanghai Dream Lsaer Tecchnology | SDL-532-1000T | |
| Laser generator (5 watt) (×1) | Newport Corp. | MILL 5sJ |
References
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