Summary
Trotz der jüngsten Fortschritte in der Gentechnik, bleibt Transfektion von humanen embryonalen Stammzellen (hES) ein launischer Prozess. Nach unserem Kenntnisstand haben systematische und effiziente Methoden, um Menschen induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) transfizieren nicht berichtet worden. Hier beschreiben wir robuste Protokolle effizient transfizieren und nucleofect menschlichen iPS.
Abstract
Genetische Veränderung ist weiterhin ein wichtiges Instrument sein, das Studium der Stammzellbiologie und darlegt mögliche klinische Anwendungen von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) 1. Während Verbesserungen in mehreren Gentransfer Methoden 2-9 beschrieben haben, bleibt Transfektion ein launischer Verfahren zur hESCs, und noch nicht in der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) berichtet worden. In diesem Video zeigen wir, wie unser Labor routinemäßig transfiziert und nucleofects menschlichen iPS Verwendung mit einem erweiterten grün fluoreszierendes Protein (eGFP) Reporterplasmid. Menschliche IPSCs angepasst und aufrechterhalten, wie Feeder-freien Kulturen, die Möglichkeit der Zuführung Zelltransfektion beseitigen und um eine effiziente Selektion stabiler transgener iPSC Klone nach der Transfektion ermöglichen. Für Nukleofektion werden menschliche iPS mit ROCK-Inhibitor 11, in kleine Klumpen von Zellen, nucleofected und Zubringer replattiert in Feederzellschicht klimatisierten trypsiniert vorbehandeltmittel-bis Zellgewinnung verbessern. Transgen-exprimierenden menschlichen iPS kann nach 6 Stunden erreicht werden. Antibiotika-Selektion wird nach 24 Stunden und stabilen transgenen Linien erscheinen innerhalb 1 Woche angewendet. Unser Protokoll ist robust und reproduzierbar für menschliche iPSC Leitungen ohne Änderung Pluripotenz dieser Zellen.
Protocol
Unser Protokoll beginnt mit einer Methode zur menschlichen iPS zur Feeder-freien Kulturen, durch Protokolle zur Transfektion menschlichen iPS mit GeneJuice (EMD) und Nukleofektion der menschlichen iPS mit einem AMAXA nuclefector nachgeschaltet anzupassen.
Hinweis: Die folgenden Verfahren werden in einem sterilen Laminarströmungshaube durchgeführt. Alle Medien und Lösungen sind äquilibriert bis 37 ° C oder Raumtemperatur bevor, wenn nicht anders angegeben.
Ein. Gründung menschlichen iPS auf Feeder-free-System
Menschliche iPS zuvor auf Feeder-Zellen aufrechterhalten werden aufgeteilt, übertragen auf Geltrex-beschichtete Schale und gepflegt für zwei Durchgängen vor Feeder-freie Transfektion.
- Auftauen Geltrex Nacht bei 4 ° C. Um Geltrex Beschichtung herzustellen, verdünnen aufgetaute Geltrex 1:50 in kaltem DMEM. Mischen Sie die Lösungen vorsichtig.
Anmerkung: Geltrex wie Matrigel ist eine lösliche Form von Basalmembran matrix gereinigte aus murinen Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Tumorzellen. Alternativ können Matrigel als extrazelluläre Matrix Feeder-freien menschlichen iPS Kulturen zu etablieren verwendet werden.
- Die gesamte Oberfläche der Vertiefungen mit Geltrex Kultur-Lösung (1 ml für eine 35-mm-Vertiefung). Coat Vertiefungen mit Geltrex bei 37 ° C Inkubator für 1 Stunde.
- Um den Durchgang menschlichen iPS, 1 ml Accutase pro Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 1 min, bis die meisten Zellen zu lösen beginnen.
Um den Durchgang menschlichen iPS, 1 ml Accutase pro Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 1 min, bis die meisten Zellen zu lösen beginnen.
- Fügen 10-15 Glasperlen zu den Zellen und schwenken Sie die Platte. 2 ml KnockOut DMEM / F12 und sanft verreiben. Übertragen Zellsuspension in ein 10 ml Zentrifugenröhrchen.
- Spin-Zellen bei 800 UpM für 3 min bei Raumtemperatur.
- Absaugen des Überstandes aus der Röhre, so dass menschliche iPSC Pellet intakt. Gently Flick Rohrdisperse Zellpellet.
- Entfernen Geltrex aus dem beschichteten gut.
- Vorsichtig resuspendieren menschlichen iPS Pellet in einem geeigneten Volumen STEMPRO. Verteilen zwischen den Wells von Feedern, abhängig von der Proliferationsrate). Menschliche IPSCs kann in einem Teilungsverhältnis von 1:2 bis 1:6 passagiert werden.
- Vorsichtig Ort in 5% CO 2-Inkubator, schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in den Vertiefungen zu gewährleisten.
- Feed-Zellen täglich bis Zellen sind bereit, wieder aufgeteilt werden (wenn die Zellen 80% Konfluenz erreichen).
- Durchgang menschlichen IPSCs auf neue Geltrex-beschichtete Vertiefung (Stufe 1.3 bis 1.9) in einem Teilungsverhältnis von 1:2. Kleine Kolonien gebildet und gleichmäßig auf Geltrex-beschichtete Vertiefung vor der Transfektion verteilt.
2. Transfektion von humanen iPS mit GeneJuice
Zellen (Anzucht auf 6-Well-Platten) sollte ca. 40 -50% konfluenten am Tag der Transfektion optimalen Transfektionseffizienz zu erreichen. Es istnicht erforderlich, das Zellmedium bis zum nächsten Tag ändern.
- Bereiten 100 ul KO-DMEM/F12 in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Fügen Sie 27 ul GeneJuice Transfektionsreagenz. Gut mischen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
- Add 4 pg Plasmid-DNA. Das Röhrchen bei Raumtemperatur für 15 min. Die Wahl von Plasmid ist entscheidend für eine optimale Transfektionseffizienz. Wir verwenden ein Plasmid mit einem verbesserten grüne Fluoreszenz-Protein (eGFP) durch CAG-Promotor 5 (PCAG-eGFP) angetrieben wird. CAG Promotor ein starker Promotor in humanen transkriptionell aktiven IPSCs und können daher verwendet werden, um die Expression des Transgens in diesen Zellen zu treiben ist. In unseren Händen hat Linearisierung von Plasmid nicht scheinen, um die Transfektionseffizienz beeinflussen.
- Fügen GeneJuice-DNA-Gemisch zu den Zellen und schwenken Sie die Platte. Spin die Platte bei 1200 UpM für 5 Minuten ('spinoculation "Methode), um den Kontakt der Mischung mit Transfektion menschlicher IPSCs auf dem gut zu erhöhen.
- Inkubieren der Zellen bei 37 unddeg; C über Nacht.
- Monitor für Transfektionseffizienz am nächsten Tag.
- Für die stabile Transfektion, ändern Medium am nächsten Tag mit frischen STEMPRO. Fügen Sie entsprechende Antibiotika-Selektion nach 24 - 48 Stunden.
3. Nucleofection der menschlichen iPS
Menschliche iPS auf Abzweige oder Geltrex angebaut werden für Nukleofektion verwendet werden. Allerdings empfehlen wir Replattierung nucleofected menschlichen iPS auf embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) oder menschliche Vorhaut-Fibroblast (HFF) Zubringer zu hohen Lebensfähigkeit der Zellen und Erholung zu gewährleisten. Mindestens 2 Millionen Zellen sollten verwendet werden, um höhere Zellüberleben nach Nukleofektion erreichen.
- Bereiten Feeder-Zellen konditionierten Medien (CM) durch Inkubation menschlichen iPS KnockOut Serum Replacement (KOSR) Medien mit Feeder-Zellen über Nacht. Sammle CM alle 24 Stunden.
Anmerkung: Jeder Mausstamm zur Herstellung Feeder-Schichten (wie BLK6, CF1 und MF1) verwendet wird, ist geeignet, um daraus fo werdenr machen CM.
- Am Tag der Nukleofektion, vorzubehandeln menschlichen IPSCs mit 10 pM ROCK Inhibitors für mindestens 1 Stunde.
- Bereiten Sie 82 ul des menschlichen Stammzellen Nucleofector Lösung in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Hinzufügen 18 ul Beiblatt 1. Gut mischen. Inkubieren bei 37 ° C für 5 Minuten.
- Vorwärmen Feeder-Zellen konditionierten Medien (CM) und 0,25% Trypsin / EDTA auf 37 ° C. Unter der Haube prelabel ein steriles 15 ml konischen Röhrchen.
- Entfernen Sie vorsichtig Medien aus menschlichen iPS Kultur nucleofected werden. Vorsichtig waschen der Zellen mit 2 ml 1X Phosphat gepufferten Lösung (PBS) pro Vertiefung. Saugen Sie die PBS. 1 ml 0,25% Trypsin pro Vertiefung. Inkubieren Zellen bei 37 ° C für 3 Minuten.
- Gently verreiben die Zellen mit 1000 ml Pipettenspitze. Waschen Sie den Boden des Bohrlochs, um sicherzustellen, dass alle menschlichen iPS vollständig abgelöst. Übertragen Zellsuspension an das markierte 15 ml konischen Röhrchen.
Hinweis: Trypsinierung in einzelne cEllen sollte unbedingt vermieden werden. Zellen sollten nur in kleinen Klumpen von Zellen verdrängt werden bestand aus etwa Drillinge von Zellen. Kleinen Klumpen von Zellen (Zelle Tripeln) wird in einzelne Zellen dissoziiert während der nachfolgenden Handhabung der Zellen.
- 9 ml MEF Medien Trypsin zu inaktivieren. Spin-Zellen bei 800 rpm für 3 Minuten. Vorsichtig den Überstand aspirieren und lassen das Zellpellet intakt.
- Die Zellen in vorgewärmten 100 ul menschlichen Stammzellen Nucleofector Lösung aus Schritt 3.3.
- Übertragen Zellen einem Nucleofector Küvette unter Verwendung einer 1 ml Pipettenspitze.
- Add 4 ug Plasmid-DNA in die Zellsuspension in der Küvette. Mix-Zellen und DNA durch vorsichtiges Schwenken. Tippen Sie auf die Küvette zweimal auf der Haube Oberfläche.
- Legen Sie die Küvette in den Nucleofector Halter. Programme verwenden, B-016. Nucleofect Zellen durch Drücken der Taste X.
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- Abrufen nucleofected Zellen aus der Küvette mit dem mitgelieferten Pasteur Plastikpipette. Recover Zellen durch Resuspendieren sie in vorgewärmte CM und ROCK-Inhibitor in ein steriles 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Inkubieren Zellen bei 37 ° C für 10 Minuten zu lassen Zellen erholen.
- Transfer-Zellen tropfenweise auf Feeder-Schichten unter Verwendung von 1 ml Pipettenspitze. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C über Nacht.
- Monitor für Transfektionseffizienz am nächsten Tag. Zur Ableitung stabiler Klone von transgenen menschlichen iPS, dass stabil exprimieren Transgen, ändern Medium am nächsten Tag mit CM und ROCK-Inhibitor. Fügen Sie entsprechende Antibiotika-Selektion nach 24 - 48 Stunden.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Discussion
Unsere Protokolle führen einfache, robuste und hoch reproduzierbare Techniken, um Transgene in menschlichen iPS einzuführen, ohne prominente toxische Wirkung und Zelltod. Menschliche IPSCs sollte in kleinere Klumpen von Zellen (5-10 Zellen) passagiert und plattiert auf Geltrex bei hoher Dichte (1:2), um eine optimale Effizienz der Transfektion in zahlreichen kleinen Kolonien gewährleisten. Für menschliche iPSC Linien, die anfälliger für Differenzierung und Zelltod sind, sollten höhere Zahl menschlicher IPSCs (bis 4 x 10 6 Zellen) für eine einzelne Nukleofektion Experiment verwendet werden. Transienten Transfektions-Assay erzeugt eine große Anzahl von Transgen-exprimierenden humanen IPSCs innerhalb von 1 Tag. Stabil transfizierte iPSC Klone treten in der Regel innerhalb von 7 Tagen, und diese transgenen Kolonien sollten bereit sein, innerhalb von drei Wochen abgeholt werden. Die Verwendung von CAG-Promotor hier beschriebenen sorgt ubiquitäre Expression von eGFP Reporter. Unter solchen Verbesserungen können unsere Protokolle in anderen Anwendungen zugeführt werden, einschließlich Überexpression, conditional Induktion Ableitung linienspezifischen Reporter Linien, shRNA oder siRNA knockdown, Gen-Targeting und homologe Rekombination.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Beschriebenen Arbeiten in diesem Manuskript wurde durch Mittel aus dem California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) für UCR Stem Cell Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Glass beads should be washed with hydrochloric acid (HCl) overnight, rinsed off with sodium hydroxide (NaOH) and distilled water, and sterilized by autoclave before use. |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
| DMEM (high glucose) | Lonza Inc. | 12-741 F | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Geltrex | Invitrogen | 12760013 | Growth factor reduced |
| GeneJuice transfection reagent | EMD Millipore | 70967 | |
| Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | L-Glutamine (Invitrogen, 25030081) can also be used instead. |
| Human iPSC KOSR media | 500 ml human ES media consists of 390 ml KnockOut DMEM/ F12, 100 ml KnockOut Serum Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. | ||
| KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
| KnockOut Serum Replacement (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| Mouse embryonic fibroblast media | MEF media consists of 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I and 1X sodium pyruvate in DMEM (high glucose) | ||
| Non essential amino acid, NEAA?(100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| Human stem cell nucleofector solution 1 with supplement | Lonza Inc. | VAPH-5012 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
| Sodium pyruvate (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
| STEMPRO medium kit | Invitrogen | A1000701 | 500 ml STEMPRO media consists of 454 ml KnockOut DMEM/ F12, 10 ml STEMPRO serum-free growth supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine serum albumin, 25%), 909 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. |
References
- Liew, C. G. Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation. Ann Med. 37, 521-532 (2005).
- Eiges, R. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homogous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).
- Siemen, H. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives. Stem Cells. 26, 525-533 (2008).
- Braam, S. R. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
- Braam, S. R. Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification. Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).
- Placantonakis, D. G. BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage. Stem Cells. 27, 521-532 (2009).
