Summary
आनुवंशिक संशोधन में हाल ही में प्रगति के बावजूद, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) अभिकर्मक एक सनकी प्रक्रिया बनी हुई है. हमारे ज्ञान करने के लिए, व्यवस्थित और कुशल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (iPSCs) transfect तरीकों को सूचित नहीं किया गया है. यहाँ, हम मजबूत करने के लिए कुशलतापूर्वक transfect और मानव iPSCs nucleofect प्रोटोकॉल का वर्णन करता है.
Abstract
आनुवंशिक संशोधन करने के लिए स्टेम कोशिका जीव विज्ञान का अध्ययन करने में और आगे मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) 1 के संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों की स्थापना में एक आवश्यक उपकरण के लिए जारी है. हालांकि कई जीन प्रसव के तरीके में सुधार 2-9 वर्णित किया गया है, अभिकर्मक hESCs के लिए एक सनकी प्रक्रिया रहता है, और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (iPSCs) में अभी तक नहीं किया गया है की सूचना दी. इस वीडियो में, हम प्रदर्शन कैसे हमारी प्रयोगशाला नियमित transfects और मानव iPSCs nucleofects एक बढ़ाया हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन रिपोर्टर (EGFP) के साथ प्लाज्मिड का उपयोग. मानव iPSCs अनुकूलित कर रहे हैं और फीडर मुक्त संस्कृतियों के रूप में बनाए रखा फीडर सेल अभिकर्मक की संभावना को खत्म करने और स्थिर ट्रांसजेनिक अभिकर्मक के बाद iPSC क्लोनों के कुशल चयन की अनुमति. के लिए nucleofection, मानव iPSCs रॉक 11 अवरोध करनेवाला, कोशिकाओं के छोटे clumps, सेल वातानुकूलित फीडर में भक्षण पर nucleofected और replated में trypsinized के साथ पूर्व इलाजसेल वसूली बढ़ाने के लिए मध्यम. ट्रांसजीन व्यक्त मानव iPSCs 6 घंटे के बाद प्राप्त किया जा सकता है. एंटीबायोटिक चयन 24 घंटे और स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों 1 सप्ताह के भीतर होने के बाद लागू किया जाता है. हमारा प्रोटोकॉल मजबूत और इन कोशिकाओं के pluripotency फेरबदल के बिना मानव iPSC लाइनों के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है.
Protocol
हमारा प्रोटोकॉल एक फीडर मुक्त संस्कृतियों, मानव iPSCs transfecting (ईएमडी) GeneJuice और मानव एक AMAXA nuclefector डिवाइस का उपयोग iPSCs की nucleofection का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल के द्वारा पीछा करने के लिए मानव iPSCs अनुकूल विधि के साथ शुरू होता है.
नोट: निम्न कार्यविधियों एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं. सभी मीडिया और समाधान के लिए 37 डिग्री सेल्सियस या शुरू करने से पहले जब तक अन्यथा निर्दिष्ट कमरे के तापमान equilibrated हैं.
1. फीडर मुक्त प्रणाली पर मानव iPSCs की स्थापना
मानव iPSCs पहले फीडर कोशिकाओं पर बनाए रखा है, में विभाजित किया जा सकता है पकवान Geltrex लेपित पर स्थानांतरित और दो मार्ग के लिए मुक्त अभिकर्मक फीडर पहले बनाए रखा.
- Geltrex रातोंरात पिघलना को 4 डिग्री सेल्सियस में के Geltrex कोटिंग तैयार, ठंड DMEM में डीफ़्रॉस्ट किए गए 1:50 Geltrex पतला. मिश्रण धीरे समाधान.
नोट: Matrigel तरह Geltrex तहखाने झिल्ली matr के एक घुलनशील फार्मmurine से ix शुद्ध Engelbreth होल्म - झुंड (EHS) ट्यूमर कोशिकाओं. वैकल्पिक रूप से, Matrigel फीडर मुक्त मानव iPSC संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक बाह्य मैट्रिक्स के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- संस्कृति कुओं की पूरी सतह Geltrex समाधान (35 मिमी अच्छी तरह से करने के लिए 1 मिलीग्राम) के साथ कवर. कोट 37 में Geltrex साथ कुओं ° सी इनक्यूबेटर 1 घंटे के लिए.
- बीतने के मानव iPSCs, accutase के 1 मिलीग्राम प्रति अच्छी तरह से जोड़ने और 37 में ° 1 मिनट के लिए सी सेते हैं जब तक सबसे कोशिकाओं को अलग से शुरू करते हैं.
बीतने के मानव iPSCs, accutase के 1 मिलीग्राम प्रति अच्छी तरह से जोड़ने और 37 में ° 1 मिनट के लिए सी सेते हैं जब तक सबसे कोशिकाओं को अलग से शुरू करते हैं.
- कोशिकाओं और धीरे थाली ज़ुल्फ़ 10-15 ग्लास मनकों जोड़ें. नॉकआउट DMEM / F12 के 2 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे महीन चुर्ण बनाना. एक 10 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थानांतरण सेल निलंबन.
- कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 800 rpm पर कोशिकाओं स्पिन.
- ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला Aspirate, मानव iPSC गोली बरकरार छोड़ने. धीरे ट्यूब झटकाफैलाने सेल गोली.
- लेपित अच्छी तरह से Geltrex निकालें.
- धीरे STEMPRO का एक उचित मात्रा में मानव iPSC गोली resuspend. फीडरों के कुओं के बीच वितरित, प्रसार दर पर निर्भर करता है). मानव iPSCs 1:02-01:06 के अनुपात में विभाजित passaged जा सकता है.
- ध्यान जगह 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर, थाली ध्यान ज़ुल्फ़ कुओं भर में कोशिकाओं की एक भी वितरण सुनिश्चित करने में.
- फ़ीड कोशिकाओं तक दैनिक कोशिकाओं के लिए फिर से विभाजित किया जा के लिए तैयार कर रहे हैं (जब कोशिकाओं को 80% confluency तक पहुँचने).
- अच्छी तरह से नए Geltrex लेपित पर बीतने के 1:2 के एक विभाजन के अनुपात में मानव iPSCs (1.3-1.9 कदम). छोटी कालोनियों और गठन किया जाना चाहिए अच्छी तरह Geltrex लेपित अभिकर्मक करने से पहले पर समान रूप से वितरित की.
2. GeneJuice साथ मानव iPSCs अभिकर्मक
6 अच्छी तरह प्लेटें पर विकसित कोशिकाओं इष्टतम अभिकर्मक दक्षता हासिल अभिकर्मक के दिन पर लगभग 40 -50 सहधारा% होना चाहिए. यह हैअगले दिन तक सेल मध्यम बदलने के लिए आवश्यक नहीं है.
- एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में 100 μl KO-DMEM/F12 तैयार. 27 μl GeneJuice अभिकर्मक अभिकर्मक जोड़ें. अच्छी तरह से मिलाएं. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 4 ग्राम प्लास्मिड डीएनए जोड़ें. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए ट्यूब सेते हैं. प्लाज्मिड की विकल्प इष्टतम अभिकर्मक दक्षता के लिए महत्वपूर्ण है. हम एक बढ़ाया हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (EGFP) 5 प्रमोटर (pCAG EGFP) सीएजी द्वारा संचालित के साथ एक प्लाज्मिड का उपयोग करें. प्रमोटर सीएजी कि transcriptionally मानव iPSCs में सक्रिय है और इस तरह इन कोशिकाओं में transgene अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक मजबूत प्रमोटर है. हमारे हाथ में, प्लाज्मिड के linearization अभिकर्मक क्षमता को प्रभावित नहीं मालूम था.
- कोशिकाओं और प्लेट ज़ुल्फ़ को GeneJuice डीएनए मिश्रण जोड़ें. 5 मिनट के लिए 1200 rpm ('' spinoculation 'विधि) पर थाली स्पिन करने के लिए अच्छी तरह पर मानव iPSCs के के साथ अभिकर्मक मिश्रण के संपर्क में वृद्धि.
- 37 & कोशिकाओं सेतेडिग्री; सी रातोंरात.
- अभिकर्मक दक्षता के लिए अगले दिन की निगरानी.
- स्थिर अभिकर्मक के लिए, मध्यम अगले दिन बदलने के ताजा STEMPRO साथ. 24 - 48 घंटे के बाद उचित एंटीबायोटिक चयन जोड़ें.
3. मानव iPSCs की Nucleofection
मानव फ़ीडर या Geltrex पर हो iPSCs nucleofection के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, हम दृढ़ता से माउस भ्रूणीय (MEF) fibroblast या मानव चमड़ी (HFF) fibroblast उच्च सेल व्यवहार्यता और वसूली सुनिश्चित करने के भक्षण पर nucleofected मानव iPSCs replating करने की सलाह देते हैं. कम से कम 2 लाख कोशिकाओं उच्च सेल nucleofection के बाद अस्तित्व को प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए.
- मानव iPSC नॉकआउट फीडर कोशिकाओं के साथ सीरम रिप्लेसमेंट मीडिया (KOSR) incubating रातोंरात फीडर सेल वातानुकूलित मीडिया (मुख्यमंत्री) को तैयार करो. मुख्यमंत्री हर 24 घंटे में ले लीजिए.
नोट: कोई माउस फीडर परतों (जैसे CF1 BLK6, और MF1) तैयार करने के लिए इस्तेमाल करने के लिए इस्तेमाल किया जा उपयुक्त तनाव हैr मुख्यमंत्री बनाने.
- Nucleofection के दिन पर, कम से कम 1 घंटे के लिए 10 सुक्ष्ममापी रॉक अवरोध करनेवाला के साथ मानव iPSCs पूर्व इलाज.
- एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में मानव स्टेम सेल nucleofector समाधान के 82 μl तैयार. 18 μl पूरक 1 जोड़ें. अच्छी तरह से मिलाएं. 37 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए समाधान सेते हैं.
- वातानुकूलित पूर्व गर्म फीडर सेल (मुख्यमंत्री) मीडिया और 0.25% trypsin / EDTA 37 डिग्री सेल्सियस हुड के तहत, एक prelabel बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब.
- सावधानी से मानव iPSC संस्कृति से मीडिया को दूर करने के लिए nucleofected. धीरे से अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर 1X फॉस्फेट buffered समाधान (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं धो लो. पीबीएस Aspirate. अच्छी तरह से प्रति 0.25% trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 3 मिनट के लिए कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- धीरे 1000 मिलीलीटर विंदुक टिप के साथ कोशिकाओं महीन चुर्ण बनाना. सुनिश्चित करें कि सभी मानव iPSCs को पूरी तरह से अलग कर रहे हैं बनाने के लिए अच्छी तरह के नीचे धो लें. लेबल 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण.
नोट: एकल ग में TrypsinizationElls सख्ती से बचा जाना चाहिए. कोशिकाओं ही कोशिकाओं के छोटे clumps में उखाड़ फेंकना जाना चाहिए कोशिकाओं के लगभग त्रिक के शामिल है. कोशिकाओं के छोटे clumps (सेल ट्रिपल) एकल कक्षों dissociated में कोशिकाओं के बाद से निपटने के दौरान किया जाएगा.
- 9 मिलीलीटर MEF मीडिया जोड़ें trypsin निष्क्रिय. 800 rpm पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं को स्पिन. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate और सेल गोली अक्षुण्ण छोड़.
- 3.3 कदम से मानव स्टेम सेल nucleofector समाधान की prewarmed 100 μl में कोशिकाओं Resuspend.
- कोशिकाओं स्थानांतरण एक nucleofector क्युवेट के लिए एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप का उपयोग.
- क्युवेट में सेल निलंबन में प्लास्मिड डीएनए के 4 ग्राम जोड़ें. कोमल घूमता कोशिकाओं और डीएनए मिक्स. क्युवेट हुड सतह पर दो बार टैप करें.
- Nucleofector धारक में क्युवेट डालें. B-016 कार्यक्रमों का प्रयोग करें. बटन एक्स दबाकर Nucleofect कोशिकाओं
<
- प्रदान की पाश्चर प्लास्टिक विंदुक का उपयोग क्युवेट से nucleofected कोशिकाओं को पुनः प्राप्त. कोशिकाओं उन्हें prewarmed रॉक और एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में अवरोध करनेवाला मुख्यमंत्री में resuspending द्वारा पुनर्प्राप्त. 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए दो कोशिकाओं की वसूली सेते हैं.
- फीडर 1 मिलीलीटर विंदुक टिप का उपयोग परतों पर स्थानांतरण ड्रॉप - वार कोशिकाओं. 37 ° रातोंरात सी कोशिकाओं सेते हैं.
- अभिकर्मक दक्षता के लिए अगले दिन की निगरानी. ट्रांसजेनिक मानव iPSCs के स्थिर क्लोन प्राप्त है कि stably transgene व्यक्त, मध्यम बदलने के मुख्यमंत्री और रॉक अवरोध करनेवाला के साथ अगले दिन. 24 - 48 घंटे के बाद उचित एंटीबायोटिक चयन जोड़ें.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
Discussion
हमारे सरल, मजबूत और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक में प्रोटोकॉल परिणाम प्रमुख विषाक्त प्रभाव और कोशिका मृत्यु के बिना मानव iPSCs में transgenes लागू करने के लिए. मानव iPSCs कोशिकाओं के छोटे clumps (5-10 कोशिकाओं) में passaged किया जाना चाहिए और उच्च घनत्व (1:2) में Geltrex पर चढ़ाया कई छोटी कालोनियों में इष्टतम अभिकर्मक दक्षता सुनिश्चित करने. कि भेदभाव और कोशिका मृत्यु होने का खतरा हैं मानव iPSC लाइनों के लिए, मानव iPSCs की अधिक संख्या (4 एक्स 10 6 कोशिकाओं) एक एकल nucleofection प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. क्षणिक अभिकर्मक परख transgene व्यक्त मानव iPSCs के 1 दिन के भीतर बड़ी संख्या उत्पन्न करता है. Stably ट्रांसफ़ेक्ट iPSC क्लोनों आमतौर पर 7 दिनों के भीतर दिखाई देते हैं, और इन ट्रांसजेनिक कालोनियों के तीन सप्ताह के भीतर उठाया जा करने के लिए तैयार होना चाहिए. सीएजी प्रमोटर का उपयोग यहाँ वर्णित EGFP संवाददाता की सर्वव्यापक अभिव्यक्ति सुनिश्चित करता है. इस तरह के सुधार के तहत, हमारे प्रोटोकॉल अन्य अनुप्रयोगों में खिलाया जा सकता है overexpression, ग सहित,onditional प्रेरण, वंश विशिष्ट संवाददाता लाइनों, shRNA या siRNA पछाड़ना की व्युत्पत्ति, जीन लक्ष्यीकरण और मुताबिक़ पुनर्संयोजन.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
काम इस पांडुलिपि में वर्णित UCR स्टेम सेल कोर के लिए पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) से धन के द्वारा ही संभव बनाया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Glass beads should be washed with hydrochloric acid (HCl) overnight, rinsed off with sodium hydroxide (NaOH) and distilled water, and sterilized by autoclave before use. |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
| DMEM (high glucose) | Lonza Inc. | 12-741 F | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Geltrex | Invitrogen | 12760013 | Growth factor reduced |
| GeneJuice transfection reagent | EMD Millipore | 70967 | |
| Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | L-Glutamine (Invitrogen, 25030081) can also be used instead. |
| Human iPSC KOSR media | 500 ml human ES media consists of 390 ml KnockOut DMEM/ F12, 100 ml KnockOut Serum Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. | ||
| KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
| KnockOut Serum Replacement (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| Mouse embryonic fibroblast media | MEF media consists of 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I and 1X sodium pyruvate in DMEM (high glucose) | ||
| Non essential amino acid, NEAA?(100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| Human stem cell nucleofector solution 1 with supplement | Lonza Inc. | VAPH-5012 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
| Sodium pyruvate (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
| STEMPRO medium kit | Invitrogen | A1000701 | 500 ml STEMPRO media consists of 454 ml KnockOut DMEM/ F12, 10 ml STEMPRO serum-free growth supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine serum albumin, 25%), 909 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. |
References
- Liew, C. G. Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation. Ann Med. 37, 521-532 (2005).
- Eiges, R. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homogous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).
- Siemen, H. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives. Stem Cells. 26, 525-533 (2008).
- Braam, S. R. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
- Braam, S. R. Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification. Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).
- Placantonakis, D. G. BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage. Stem Cells. 27, 521-532 (2009).
