Summary
למרות הפיתוחים אחרונים בהתאמה גנטית, transfection של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) נותר תהליך גחמני. למיטב ידיעתנו, שיטות שיטתיות ויעילות לתאי אדם transfect מושרים pluripotent גזע (iPSCs) לא דווחה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עמידים ביעילות transfect וnucleofect iPSCs אדם.
Abstract
שינוי גנטי ממשיך להיות כלי חיוני בלימוד ביולוגיה של תאי גזע וביישומים קליניים המפרט פוטנציאליים של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) 1. למרות השיפור במספר שיטות מסירת גן תואר 2-9, transfection נותר תהליך קפריזי לhESCs, ועדיין לא דווח בתאים אנושיים מושרים pluripotent גזע (iPSCs). בסרטון הזה, אנחנו מדגימים איך המעבדה שלנו באופן שגרתי וtransfects nucleofects iPSCs אדם באמצעות פלסמיד עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר כתב (eGFP). iPSCs אדם מותאם ומתוחזק כתרבויות מזין חינם כדי לשלול את האפשרות של transfection תא מזין ויעילה המאפשרת בחירה של שיבוטי iPSC מהונדסים יציבים לאחר transfection. לnucleofection, iPSCs אדם מראש שטופל במעכבי רוק 11, trypsinized לתוך גושים קטנים של תאים, וnucleofected replated על מתקני האכלה במזין תא ממוזגבינוני כדי לשפר את התאוששות תא. iPSCs האדם transgene מבטא-ניתן לקבל לאחר 6 שעות. בחירת אנטיביוטיקה חלה לאחר 24 שעות וקווים הטרנסגניים יציבים מופיעות בתוך השבוע 1. הפרוטוקול שלנו הוא חזק ולשעתק לקווי iPSC אדם מבלי לשנות pluripotency של תאים אלה.
Protocol
הפרוטוקול שלנו מתחיל בשיטה להתאים iPSCs אדם לתרבויות נטולות מזין, ואחרי פרוטוקולים לtransfecting iPSCs אדם באמצעות GeneJuice וnucleofection של iPSCs אדם באמצעות מכשיר nuclefector AMAXA (EMD).
הערה: ההליכים הבאים יבוצעו בברדס זרימה למינרית סטרילי. כל כלי התקשורת והפתרונים הם מתאזנת עד 37 ° C או טמפרטורת חדר לפני התחילה אלא אם צוין אחר.
1. הקמת iPSCs אדם במערכת מזין חינם
iPSCs אדם נשמר בעבר בתאים מזינים ניתן לפצל, מועבר על גבי צלחת Geltrex מצופית ונשמר במשך שתי פסקאות לפני transfection מזין חינם.
- הפשר Geltrex הלילה ב 4 ° C. כדי להכין את ציפוי Geltrex, לדלל להפשיר Geltrex 1:50 בDMEM הקר. מערבב בעדינות את הפתרונים.
הערה: Geltrex, כמו Matrigel היא צורה מסיסה של matr קרום המרתףix מטוהר מעכברי Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) תאים סרטניים. לחלופין, Matrigel יכול לשמש כמטריצה להקים תרבויות iPSC אדם מזין חינם.
- מכסה את כל פני השטח של בארות תרבות עם Geltrex פתרון (1 מ"ל ל35-מ"מ היטב). מעייל עם בארות Geltrex על 37 מעלות צלזיוס חממה במשך שעה 1.
- לiPSCs מעבר אדם, להוסיף 1 מ"ל של accutase לטוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות עד שרוב התאים להתחיל לניתק.
לiPSCs מעבר אדם, להוסיף 1 מ"ל של accutase לטוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות עד שרוב התאים להתחיל לניתק.
- הוסף 10-15 חרוזי זכוכית לתאים ועדינות עיטורי הצלחת. הוסף 2 מ"ל של נוקאאוט DMEM / F12 ועדינות triturate. העברת השעית תא לצינור צנטריפוגה 10 מ"ל.
- ספין תאים ב800 סל"ד ל3 דקות בטמפרטורת חדר.
- לשאוב supernatant מהצינור, ומשאיר אדם iPSC גלולה ללא פגע. עדינות קפיצית לצינורלפזר תא גלול.
- הסר Geltrex מהבאר המצופית.
- resuspend iPSC גלולה אנושית עדינות בנפח מתאים של STEMPRO. להפיץ בין בארות של מתקני האכלה, תלוי בשיעור ההפצה). iPSCs אדם ניתן passaged ביחס פיצול של 1:02-01:06.
- בזהירות מקום לCO 2 חממה 5%, מערבולת הצלחת בקפידה כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים ברחבי הבארות.
- תאי הזנה יומיים עד תאים מוכנים לנפרד שוב (כאשר תאים להגיע 80% confluency).
- iPSCs Passage אדם על כן Geltrex המצופה חדש (שלב 1.3-1.9) בביחס פיצול של 1:2. מושבות קטנות צריכות להיוצר ומתחלקות באופן שווה על מצופה Geltrex היטב לפני transfection.
2. Transfection של iPSCs אדם עם GeneJuice
תאים (גדל על צלחות 6-כן) צריכים להיות כ -40% -50 confluent ביום transfection כדי להשיג יעילות transfection אופטימלית. זהאין צורך לשנות את המדיום הסלולרי עד ליום המחרת.
- הכן 100 KO-DMEM/F12 μl בצינור סטרילי 1.5 מ"ל אפנדורף. הוסף מגיב transfection GeneJuice μl 27. מערבב היטב. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
- הוסף 4 DNA פלסמיד מיקרוגרם. דגירת הצינור בטמפרטורת חדר במשך 15 דקות. הבחירה של פלסמיד היא קריטית ליעילות transfection אופטימלית. אנו משתמשים בפלסמיד עם חלבון משופר ירוק פלואורסצנטי (eGFP) מונע על ידי אמרגן CAG 5 (pCAG-eGFP). CAG אמרגן הוא אמרגן חזק שהוא תעתיק פעיל בiPSCs אדם ולכן ניתן להשתמש בכונן ביטוי transgene בתאים אלה. בידות שלנו, linearization של פלסמיד לא נראה להשפיע על יעילות transfection.
- הוסף תערובת GeneJuice-DNA לתאים וקרונות הצלחת. ספין הצלחת ב 1200 סל"ד במשך 5 דקות (השיטה 'spinoculation') כדי להגדיל את הקשר של תערובת transfection עם iPSCs אדם על הבאר.
- דגירת התאים ב 37 &מעלות; C למשך הלילה.
- לפקח על יעילות transfection למחרת.
- לtransfection היציב, לשנות בינוני למחרת עם STEMPRO טרי. הוסף בחירת אנטיביוטיקה מתאימה אחרי 24 - 48 שעות.
3. Nucleofection של iPSCs אדם
iPSCs אדם גדל על מתקני האכלה או Geltrex יכול לשמש לnucleofection. עם זאת, אנו ממליצים בחום replating iPSCs האדם nucleofected על פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) או פיברובלסטים עורלה אנושיים (HFF) ניזונים כדי להבטיח כדאיויות תא גבוהות והתאוששות. לפחות 2 מיליון תאים יש להשתמש כדי להשיג הישרדות תא גבוהה יותר בעקבות nucleofection.
- הכן תקשורת הממוזגת מזין תאים (CM) על ידי דוגר נוקאאוט iPSC אדם החלפת מדיה סרום (KOSR) עם תאים מזינים בן לילה. איסוף CM כל 24 שעות.
הערה: כל עכבר זן המשמש להכנת שכבות מזינות (כגון BLK6, CF1 וMF1) מתאימה לשימוש for עושה סי.
- ביום nucleofection, טרום לטפל iPSCs אדם עם מעכב ROCK מיקרומטר 10 לפחות שעה 1.
- הכן 82 μl של פתרון nucleofector תאי גזע אנושי בצינור סטרילי 1.5 מ"ל אפנדורף. הוסף תוסף 1 18 μl. מערבב היטב. דגירת פתרון על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- תקשורת מזין מראש חם תא ממוזג (CM) ו0.25% טריפסין / EDTA עד 37 ° C. מתחת למכסה המנוע, prelabel צינור אחד סטרילי 15 מיליליטר חרוטים.
- מוציא בזהירות מתקשורת תרבות iPSC האנושית להיות nucleofected. לשטוף בעדינות את התאים עם פתרון 2 מ"ל 1X פוספט שנאגר (PBS) לטוב. לשאוב PBS. הוסף 1 מ"ל של טריפסין 0.25% לטובים. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
- עדינות triturate התאים עם טיפ 1000 מ"ל פיפטה. שטוף את תחתית הבאר כדי לוודא שכל iPSCs האדם מנותק לגמרי. העברת השעית תא לצינור כותרתו 15 מיליליטר חרוטים.
הערה: לאחת Trypsinization גאמות בהחלט יש להימנע. תאים צריכים לעזוב רק לתוך גושים קטנים של תאים, מונה כשלישייה של תאים. גושים קטנים של תאים (תאי לשות) יהיו ניתקו לתוך תאים בודדים בטיפול הבא של התאים.
- הוסף 9 מ"ל MEF תקשורת להשבית טריפסין. ספין תאים ב800 סל"ד במשך 3 דקות. בזהירות לשאוב supernatant ולהשאיר גלולת התא שלם.
- Resuspend תאים ב100 μl prewarmed של פתרון אנושי מתאי הגזע nucleofector שלב 3.3.
- העברת תאים לקובט nucleofector באמצעות טיפ 1 מיליליטר פיפטה.
- הוסף 4 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לתוך השעית התא בקובט. מערבב תאים ו-DNA על ידי מתערבל עדין. קש קובט פעמים על פני שטח מכסה המנוע.
- הכנס את קובט לתוך מחזיק nucleofector. השתמש בתוכניות B-016. תאי Nucleofect על ידי לחיצה על הכפתור X.
<
- יחזרו תאי nucleofected מקובט באמצעות פיפטה ספקה פסטר הפלסטיק. שחזור תאים על ידי resuspending בסנטימטר prewarmed ומעכב ROCK לתוך צינור סטרילי 1.5 מ"ל אפנדורף. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לאפשר תאים להתאושש.
- תאי העברה-חכמים שחרר אל שכבות מזין באמצעות טיפ 1 מ"ל פיפטה. דגירת התאים ב 37 ° C למשך הלילה.
- לפקח על יעילות transfection למחרת. לגזור שיבוטים יציבים של iPSCs אדם המהונדס שיציבות להביע transgene, לשנות בינוני למחרת עם CM ומעכב ROCK. הוסף בחירת אנטיביוטיקה מתאימה אחרי 24 - 48 שעות.
4. נציג תוצאות:
Discussion
תוצאת פרוטוקולינו בטכניקות פשוטות, חזקות ולשעתק מאוד להציג transgenes לiPSCs אדם ללא השפעה רעילה בולטת ומוות של תאים. iPSCs אדם צריך להיות passaged לתוך גושים קטנים יותר של תאים (תאים 5-10) ומצופה על Geltrex בצפיפות גבוהה (1:2) על מנת להבטיח יעילות אופטימלית transfection במושבות קטנות רבות. לקווי iPSC אדם שנוטים יותר למות בידול ותא, מספר גבוה יותר של iPSCs אדם (עד 4 X 10 6 תאים) אמור לשמש לניסוי nucleofection אחת. assay transfection חלוף יוצר מספר גדול של transgene-לבטא iPSCs אדם ביום 1. שיבוטי iPSC transfected ביציבות בדרך כלל מופיעים בתוך 7 ימים, והמושבות המהונדסות האלה צריכות להיות מוכנות שיבואו לקחת בתוך שלושה שבועות. השימוש במקדם CAG מתואר כאן מבטיח ביטוי בכל מקום בכתב eGFP. תחת שיפורים כאלה, הפרוטוקולים שלנו יכולים להיות מוזנים לתוך יישומים אחרים, כולל ביטוי יתר, גאינדוקצית onditional, גזירה של קווי שושלת ספציפיים כתב, shRNA או מציאת siRNA, גן המיקוד ורקומבינציה ההומולוגית.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
העבודה מתוארת בכתב היד הזה התאפשר הודות למימון ממכון קליפורניה לרפואת הרגנרציה (CIRM) לליבת תאי גזע UCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Glass beads should be washed with hydrochloric acid (HCl) overnight, rinsed off with sodium hydroxide (NaOH) and distilled water, and sterilized by autoclave before use. |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
| DMEM (high glucose) | Lonza Inc. | 12-741 F | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Geltrex | Invitrogen | 12760013 | Growth factor reduced |
| GeneJuice transfection reagent | EMD Millipore | 70967 | |
| Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | L-Glutamine (Invitrogen, 25030081) can also be used instead. |
| Human iPSC KOSR media | 500 ml human ES media consists of 390 ml KnockOut DMEM/ F12, 100 ml KnockOut Serum Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. | ||
| KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
| KnockOut Serum Replacement (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| Mouse embryonic fibroblast media | MEF media consists of 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I and 1X sodium pyruvate in DMEM (high glucose) | ||
| Non essential amino acid, NEAA?(100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| Human stem cell nucleofector solution 1 with supplement | Lonza Inc. | VAPH-5012 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
| Sodium pyruvate (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
| STEMPRO medium kit | Invitrogen | A1000701 | 500 ml STEMPRO media consists of 454 ml KnockOut DMEM/ F12, 10 ml STEMPRO serum-free growth supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine serum albumin, 25%), 909 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. |
References
- Liew, C. G. Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation. Ann Med. 37, 521-532 (2005).
- Eiges, R. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homogous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).
- Siemen, H. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives. Stem Cells. 26, 525-533 (2008).
- Braam, S. R. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
- Braam, S. R. Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification. Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).
- Placantonakis, D. G. BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage. Stem Cells. 27, 521-532 (2009).
