Summary
유전자 변형의 최근 발전에도 불구하고, 인간 배아 줄기 세포 (HESCs)의 transfection은 변덕 과정 남아있다. 우리의 지식, 인간 유도 만능 줄기 세포를 (iPSCs) transfect하는 체계적이고 효율적인 방법은보고되지 않았습니다. 여기, 우리는 효율적으로 transfect과 인간 iPSCs를 nucleofect하는 강력한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
유전자 변형은 줄기 세포 생물학을 연구와 인간 배아 줄기 세포 (HESCs) 1의 잠재적 인 임상 응용 프로그램을 명시 설정에 필수적인 도구가 될 계속하고 있습니다. 여러 유전자 전달 방법의 개선이 2-9에 설명되어 있지만, transfection은 HESCs의 변덕 과정 그대로 남아 있으며, 아직 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)에보고되지 않았습니다. 이 동영상에서는, 우리는 우리 연구소가 정기적으로 transfects 및 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 기자와 플라스미드를 사용 인간 iPSCs를 nucleofects 방법을 보여줍니다. 인간 iPSCs는 적응과 피더 세포 transfection의 가능성을 제거하고 transfection에 따라 안정적으로 유전자 변형 iPSC의 클론의 효율적인 선택을 허용하도록 피더 - 무료 문화로 유지됩니다. nucleofection를 들어, 인간의 iPSCs는 피더 셀이 설치된에 모이통에 nucleofected과 replated 세포의 작은 clumps로 trypsinized ROCK 억제제를 11으로 미리 처리됩니다셀 복구를 향상 할 매체입니다. Transgene - 표현 인간 iPSCs은 6 시간 후 얻을 수 있습니다. 항생제 선택은 24 시간 안정적으로 유전자 변형 라인이 1 주일 이내에 게재 된 후 적용됩니다. 우리 프로토콜은 견고하고 이러한 세포의 pluripotency를 변경하지 않고 인간의 iPSC 라인에 재현합니다.
Protocol
우리 프로토콜은 GeneJuice (EMD)와 AMAXA nuclefector 장치를 사용하여 인간의 iPSCs의 nucleofection를 사용하여 인간의 iPSCs를 transfecting을위한 프로토콜 다음 피더 - 무료 문화에 인간의 iPSCs을 적용 할 수있는 방법으로 시작합니다.
참고 : 다음 절차는 무균 층류 후드에서 수행됩니다. 모든 미디어 및 솔루션은 37 ° C 또는 별도로 명시하지 않는 한 시작하기 전에 실내 온도에 equilibrated 있습니다.
1. 피더 - 무료 시스템에서 인간의 iPSCs 구축
이전 피더 세포에서 유지 관리 인력 iPSCs는 Geltrex - 코팅 접시에 양도 및 이전 피더 - 무료 transfection 두 구절에 대한 유지, 분할 할 수 있습니다.
- 4 ° C.에서 밤새 Geltrex을 해동 Geltrex 코팅을 준비하는, 차가운 DMEM에 defrosted Geltrex 1시 50분을 희석. 부드럽게 솔루션을 섞는다.
참고 : Geltrex, Matrigel 같은이 지하 막 matr의 용해 형태손쥐에서 IX 정화는 Engelbreth-Holm이 - 떼 (EHS) 종양 세포. 또한, Matrigel는 피더 - 무료 인간 iPSC 문화를 구축 할 수있는 세포 외 기질로 사용하실 수 있습니다.
- Geltrex 솔루션 (35 mm 잘 1 ML)와 문화 우물의 전체 표면을 커버. 37 번 Geltrex있는 코트는 우물 ° 1 시간 C 보육.
- 통로 인간의 iPSCs에, 당 잘 accutase 1 ML을 추가하고 대부분의 세포가 분리되기 전에는 ° C 1 분에 37 품다.
통로 인간의 iPSCs에, 당 잘 accutase 1 ML을 추가하고 대부분의 세포가 분리되기 전에는 ° C 1 분에 37 품다.
- 세포와 부드럽게 소용돌이 판에 10-15 유리 구슬을 추가합니다. 넉 아웃 DMEM / F12의 2 ML을 추가하고 부드럽게 가루로 빻다. 10 ML의 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 상온에서 3 분 800 rpm으로 세포를 봐.
- 인간 iPSC 펠렛은 그대로두고, 관에서 표면에 뜨는을 대기음. 부드럽게에 관을 버려야지세포 펠렛을 분산.
- 코팅 우물에서 Geltrex를 제거합니다.
- 부드럽게 STEMPRO의 적절한 볼륨으로 인간 iPSC 펠렛을 resuspend. ) 확산 속도에 따라 피더의 우물 사이에 배포합니다. 인간 iPSCs는 1시 2분에서 1시 6분까지의 분할 비율에 passaged 할 수 있습니다.
- 조심스럽게 장소 5% CO 2 인큐베이터 신중하게 소용돌이 판 우물에서 세포도 분포를 보장하기에.
- 세포까지 매일 피드 세포가 다시 분할 할 준비가되어 (세포가 80 % confluency에 도달했을 때).
- 1시 2분의 분할 비율에 새로운 Geltrex 코팅도로 항로 인간 iPSCs (단계 1.3-1.9). 작은 식민지가 형성하고 잘 Geltrex 코팅 transfection 이전에 균일하게 분포되어야한다.
2. GeneJuice과 인간 iPSCs의 Transfection
셀 (6 잘 접시에 성장) 최적의 transfection 효율을 달성 할 수 transfection의 날에 합류 약 40 -50 %이어야합니다. 그것은이다하지 다음 날까지 셀 매체를 변경하는 데 필요한.
- 멸균 1.5 ML eppendorf 튜브에 100 μl KO-DMEM/F12를 준비합니다. 27 μl GeneJuice의 transfection 시약을 추가합니다. 잘 섞는다. 5 분 동안 실온에서 알을 품다.
- 4 μg 플라스미드 DNA를 추가합니다. 15 분 동안 실온에서 튜브를 품다. 플라스미드의 선택은 최적의 transfection 효율을위한 중요합니다. 우리는 발기인 5 (pCAG-eGFP)를 전투 편대에 의해 구동 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP)와 플라스미드를 사용합니다. 발기인을 전투 편대 인간 iPSCs의 transcriptionally 적극적이고 따라서 이러한 세포의 transgene 표현을 유도하는 데 사용할 수있는 강력한 발기인이다. 손에서 플라스미드의 선형화는 transfection 효율에 영향을 보이지 않았다.
- 세포와 소용돌이 판에 GeneJuice-DNA 혼합물을 추가합니다. 잘에 인간의 iPSCs를 transfection 혼합물의 접촉을 높이기 위해 5 분 1,200 RPM ( 'spinoculation'방법)에서 판을 봐.
- 37 &에있는 세포를 품다℃ 일, C 하룻밤.
- 다음 날 transfection 효율 모니터링합니다.
- 안정적인 transfection를 들어, 신선한 STEMPRO으로 다음날 매체를 변경합니다. 48시간 - 24 후 적절한 항생제 선택을 추가합니다.
3. 인간 iPSCs의 Nucleofection
모이통 또는 Geltrex에 성장 인간 iPSCs는 nucleofection 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리는 강력 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 또는 인간의 포피의 섬유 아세포 (HFF) 높은 세포 생존과 복구를 보장하기 위해 피더에 nucleofected 인간 iPSCs를 replating하시기 바랍니다. 적어도 2,000,000 세포는 nucleofection에 따라 높은 세포 생존을 달성하기 위해 사용되어야합니다.
- 박 피더 세포와 세럼 교체 (KOSR) 미디어를 인간의 iPSC 넉 아웃을 잠복기에 의해 피더 셀이 설치된 미디어 (CM)를 준비합니다. CM에게 24 시간마다 수집합니다.
참고 : 피더 레이어 (예 : BLK6, CF1과 MF1 등) 준비에 사용되는 마우스 긴장은 구경이 사용하기에 적합합니다R은 CM를 갖추고 있습니다.
- nucleofection의 일에 최소 1 시간 10 μM ROCK 억제제와 인간 iPSCs를 미리 취급합니다.
- 멸균 1.5 ML eppendorf 튜브에 인간 줄기 세포 nucleofector 솔루션의 82 μl를 준비합니다. 18 μl 보충 추가 1. 잘 섞는다. 5 분에 37 ° C에서 솔루션을 품다.
- 사전 따뜻한 피더 셀이 설치된 미디어 (CM)와 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 37 ° C. 후드 아래 prelabel 한 멸균 15 ML 원뿔 튜브.
- 조심스럽게 nucleofected 할 인간 iPSC 문화에서 미디어를 제거합니다. 부드럽게 잘 당 2 ML 1X 인산 버퍼 용액 (PBS)으로 세포를 씻어. PBS를 대기음. 물론 당 0.25 %의 트립신의 1 ML을 추가합니다. 3 분에 37 ° C에서 세포를 배양.
- 부드럽게 1000 ML 피펫 팁으로 세포를 씹다. 모든 인간의 iPSCs가 완전히 분리되어 있는지 확인 할 수있는 우물의 바닥을 씻으십시오. 분류 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
참고 : 하나의 C에 Trypsinizationells는 엄격히 피해야한다. 세포의 약 세 쌍둥이의 구성 세포는 세포의 작은 clumps에 dislodged해야합니다. 세포의 작은 clumps (셀 트리플)는 세포의 후속 처리하는 동안 하나의 셀에 dissociated 될 것입니다.
- 트립신을 비활성화 9 ML MEF 미디어를 추가 할 수 있습니다. 3 분에 800 rpm으로 세포를 봐. 조심스럽게 표면에 뜨는을 기음과 셀 펠렛 그대로 둡니다.
- 단계 3.3에서 인간 줄기 세포 nucleofector 솔루션의 prewarmed 100 μl에 세포를 Resuspend.
- 1 ML 피펫 팁을 사용하여 nucleofector 큐벳에 세포를 전송합니다.
- 큐벳의 세포 현탁액에 플라스미드 DNA의 4 μg을 추가합니다. 부드러운 소용돌이에 의해 세포와 DNA를 섞는다. 후드 표면에 두 번 큐벳을 누르세요.
- nucleofector 홀더에 큐벳을 삽입합니다. 프로그램 B-016을 사용합니다. 버튼 X를 눌러 Nucleofect 세포
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- 제공된 파스퇴르 (Pasteur) 플라스틱 피펫을 사용하여 큐벳에서 nucleofected 세포를 검색합니다. 멸균 1.5 ML eppendorf 튜브에 prewarmed CM과 ROCK 억제제에서 그들을 resuspending하여 세포를 복구 할 수 있습니다. 세포가 복구하도록 10 분에 37 ° C에서 세포를 배양.
- 한 ML 피펫 팁을 사용하여 피더 레이어로 드롭 현명한 전송 세포. 37 ° C 하룻밤에 세포를 배양.
- 다음 날 transfection 효율 모니터링합니다. 유전자 변형 인간 iPSCs의 안정적인 클론을 도출 해당 안정적으로 CM과 ROCK 억제제로 다음 날 중간을 변경할 수 있으며, transgene 표현. 48시간 - 24 후 적절한 항생제 선택을 추가합니다.
4. 대표 결과 :
Discussion
간단 견고하고 높은 재현 기술에있는 우리 프로토콜 결과는 눈에 잘 띄는 독성 효과 세포 사망하지 않고 인간 iPSCs에 transgenes을 소개합니다. 인간 iPSCs는 세포의 작은 clumps (5-10 세포)에 passaged과 수많은 작은 식민지에 최적의 transfection 효율을 보장하기 위해 높은 밀도 (1시 2분)에 Geltrex에 도금해야합니다. 차별화 및 셀 죽음에 더 경향이 인간의 iPSC 라인의 경우, 인간 iPSCs 높은 번호 (최대 4 X 10 6 세포) 하나의 nucleofection 실험에 사용되어야합니다. 과도 transfection 분석은 1 일 이내 transgene - 표현 인간 iPSCs 많은 수의를 생성합니다. 안정적으로 transfected iPSC 클론은 보통 7 일 이내 표시, 이러한 유전자 변형 식민지은 3 주 내에 수령 할 준비가되어 있어야합니다. 편대의 편대장 발기인의 사용은 eGFP 기자의 유비쿼터스 표현을 보장 여기에 설명했다. 이러한 개선에서 우리의 프로토콜은 overexpression, C 등 다른 응용 프로그램에 공급 될 수onditional 유도, 혈통 별 기자 라인, shRNA 또는 siRNA의 최저의 유도, 유전자 타겟팅 및 동종 재조합.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 원고에서 설명한 작업하는 것은 UCR의 줄기 세포 핵심에 대한 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM)에서 기금에 의해 가능하게되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Glass beads should be washed with hydrochloric acid (HCl) overnight, rinsed off with sodium hydroxide (NaOH) and distilled water, and sterilized by autoclave before use. |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
| DMEM (high glucose) | Lonza Inc. | 12-741 F | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Geltrex | Invitrogen | 12760013 | Growth factor reduced |
| GeneJuice transfection reagent | EMD Millipore | 70967 | |
| Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | L-Glutamine (Invitrogen, 25030081) can also be used instead. |
| Human iPSC KOSR media | 500 ml human ES media consists of 390 ml KnockOut DMEM/ F12, 100 ml KnockOut Serum Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. | ||
| KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
| KnockOut Serum Replacement (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| Mouse embryonic fibroblast media | MEF media consists of 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I and 1X sodium pyruvate in DMEM (high glucose) | ||
| Non essential amino acid, NEAA?(100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| Human stem cell nucleofector solution 1 with supplement | Lonza Inc. | VAPH-5012 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
| Sodium pyruvate (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
| STEMPRO medium kit | Invitrogen | A1000701 | 500 ml STEMPRO media consists of 454 ml KnockOut DMEM/ F12, 10 ml STEMPRO serum-free growth supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine serum albumin, 25%), 909 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. |
References
- Liew, C. G. Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation. Ann Med. 37, 521-532 (2005).
- Eiges, R. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homogous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).
- Siemen, H. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives. Stem Cells. 26, 525-533 (2008).
- Braam, S. R. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
- Braam, S. R. Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification. Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).
- Placantonakis, D. G. BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage. Stem Cells. 27, 521-532 (2009).
