Summary
Несмотря на последние достижения в области генетической модификации, трансфекции человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) остается капризной процесса. Насколько нам известно, систематические и эффективные методы для трансфекции человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) не сообщалось. Здесь мы описываем надежные протоколы эффективно трансфекции и nucleofect ИПСК человека.
Abstract
Генетическая модификация продолжает быть важным инструментом в изучении биологии стволовых клеток и излагая потенциального клинического применения человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) 1. Хотя улучшения в нескольких методов доставки генов были описаны 2-9, трансфекции остается капризной процесс ЭСК, и до сих пор не сообщил в человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). В этом видео мы покажем, как наша лаборатория регулярно transfects и nucleofects человека ИПСК с использованием плазмиды с повышенной зеленую флуоресценцию белка (EGFP) репортер. ИПСК человека адаптированы и поддерживается как фидерных бесплатно культур исключить возможность подачи трансфекции клеток и позволяют эффективно выбор стабильной трансгенных клонов ИПСК после трансфекции. Для nucleofection, человеческие ИПСК предварительно обрабатывают с рок-ингибитора 11, трипсином на небольшие скопления клеток, nucleofected и replated на фидеров в клетке подачи кондиционеромсредой для повышения восстановления клеток. Трансгенные-экспрессирующие человеческие ИПСК может быть получен через 6 часов. Антибиотик выбора применяется после 24 часов и стабильной трансгенных линий появляются в течение 1 недели. Наш протокол является надежным и воспроизводимым для человека ИПСК линии без изменения плюрипотентности этих клеток.
Protocol
Наш протокол начинается с метода адаптации человека ИПСК фидерными без культуры, а затем протоколы для трансфекции ИПСК человека использования GeneJuice (EMD) и nucleofection из человеческих ИПСК использовании устройства AMAXA nuclefector.
Примечание: Следующие процедуры выполняются в стерильных ламинаре. Все средства массовой информации и решений уравновешивают до 37 ° С или при комнатной температуре, прежде чем начать, если не указано иное.
1. Создание ИПСК человека на фидерной системы свободного
ИПСК человека ранее поддерживали на фидерных клеток может быть разделена, переносится на Geltrex покрытием блюдо и выдерживают в течение двух местах до подачи без трансфекции.
- Оттепель Geltrex течение ночи при 4 ° C. Для подготовки Geltrex покрытие, разбавленные размороженные Geltrex 1:50 в холодном DMEM. Смешать решения мягко.
Примечание: Geltrex, как Matrigel является растворимой формы подвале MATR мембраныIX очищенный от мышиного Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) опухолевых клеток. Кроме того, Matrigel можно использовать в качестве внеклеточного матрикса установить подачи свободного человека ИПСК культур.
- Покройте всю поверхность культуры скважин с Geltrex раствор (1 мл для 35-мм хорошо). Пальто скважин с Geltrex при 37 ° C инкубаторе в течение 1 часа.
- Для прохождения ИПСК человека, добавляют 1 мл accutase на лунку и инкубировать при 37 ° С в течение 1 мин, пока большинство клетки начинают отделяться.
Для прохождения ИПСК человека, добавляют 1 мл accutase на лунку и инкубировать при 37 ° С в течение 1 мин, пока большинство клетки начинают отделяться.
- Добавить 10-15 стеклянных бус к клеткам и осторожно поворачивайте тарелку. Добавить 2 мл KnockOut DMEM / F12 и нежно растереть. Передача клеточной суспензии в 10 мл центрифужные пробирки.
- Побочные клеток на 800 оборотов в минуту в течение 3 минут при комнатной температуре.
- Супернатант из трубы, оставляя человека ИПСК гранул нетронутыми. Аккуратно вылить трубыдисперсных осадок клеток.
- Удалить Geltrex с покрытием хорошо.
- Аккуратно ресуспендирования человека ИПСК гранул в соответствующем объеме STEMPRO. Распределить между скважинами фидеров, в зависимости от скорости пролиферации). ИПСК человека можно пассировать в расколе соотношении от 1:2 до 1:6.
- Аккуратно поместите в 5% СО 2 инкубатора, вихрем пластины тщательно, чтобы гарантировать равномерное распределение клеток по скважинам.
- Поток клетки ежедневно, пока клетки готовы быть разделена еще раз (когда клетки достигают 80% слияния).
- Прохождение человека ИПСК на новые Geltrex покрытием хорошо (шаг 1,3 до 1,9) в расколе соотношении 1:2. Малый колонии должны быть сформированы и распределены равномерно на Geltrex покрытием и до трансфекции.
2. Трансфекция человека ИПСК с GeneJuice
Cells (выросла на 6-луночные планшеты) должно быть примерно 40 -50% сливающийся в день трансфекции для достижения оптимальной эффективности трансфекции. ЭтоНет необходимости менять клеточной среде до следующего дня.
- Подготовка 100 мкл KO-DMEM/F12 в стерильный 1,5 мл трубки Эппендорф. Добавить 27 мкл реагента трансфекции GeneJuice. Все хорошо перемешать. Выдержите при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Добавить 4 мкг плазмидной ДНК. Выдержите трубки при комнатной температуре в течение 15 мин. Выбор плазмида имеет решающее значение для оптимальной эффективности трансфекции. Мы используем плазмиды с повышенной зеленой флуоресценции (EGFP) обусловлен CAG промоутер 5 (pCAG-EGFP). CAG промоутер сильный промотор, который транскрипционно активное участие в ИПСК человека и поэтому может быть использован для экспрессии трансгенов в этих клетках. В наших руках, линеаризации плазмиды, похоже, не влияет на эффективность трансфекции.
- Добавить GeneJuice-смесь ДНК в клетки и вращать пластину. Побочные пластины при 1200 оборотов в минуту в течение 5 минут (метод "spinoculation"), чтобы увеличить контакт трансфекции смеси с человека ИПСК на скважине.
- Инкубируйте клетки при 37 иградусов, в течение ночи.
- Монитор для эффективности трансфекции на следующий день.
- Для стабильной трансфекции, изменение средней следующий день с новыми STEMPRO. Добавить соответствующий антибиотик выбора после 24 - 48 часов.
3. Nucleofection из ИПСК человека
ИПСК человека, выращенных на фидеры или Geltrex может быть использован для nucleofection. Тем не менее, мы настоятельно рекомендуем replating nucleofected человека ИПСК на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) или человеческие фибробласты крайней плоти (HFF) питатели для обеспечения высокой жизнеспособности клеток и восстановление. По крайней мере 2 миллиона клеток должны быть использованы для достижения более высокой выживаемости клеток после nucleofection.
- Подготовка фидерной ячейки кондиционированных сред (СМ) путем инкубации человека ИПСК KnockOut Сыворотка Замена (KOSR) средах с фидерных клеток в течение ночи. Сбор CM каждые 24 часов.
Примечание: Любые мыши штамма используют для приготовления подачи слоев (например, BLK6, CF1 и MF1) подходит для использования FOГ решений CM.
- В день nucleofection, предварительно лечить человека ИПСК с 10 мкМ ингибитора ROCK минимум на 1 час.
- Подготовьте 82 мкл человеческого решение клетки стволовые nucleofector в стерильный 1,5 мл трубки Эппендорф. Добавить 18 мкл дополнения 1. Все хорошо перемешать. Инкубируйте раствора при 37 ° С в течение 5 мин.
- Предварительно теплой подачи клетки-кондиционированной среды (CM) и 0,25% трипсин / ЭДТА до 37 ° C. Под капотом, prelabel один стерильные 15 мл коническую трубку.
- Осторожно снимите средств массовой информации из ИПСК человека культуры, который будет nucleofected. Осторожно промыть клетки с 2 мл 1X фосфатным буферным раствором (PBS) на лунку. Аспирируйте PBS. Добавить 1 мл 0,25% трипсина на лунку. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 3 минут.
- Аккуратно растереть клетки с 1000 кончиком пипетки мл. Вымойте дно колодца, чтобы убедиться, что все человеческие ИПСК полностью снята. Передача клеточной суспензии с меченым 15 мл коническую трубку.
Примечание: трипсинизации в одну слоктей должны строго избегать. Клетки должны быть смещены только на небольшие скопления клеток состояла примерно из тройки клеток. Малый скопления клеток (клетки троек) будет распадается на отдельные клетки во время последующей обработки клеток.
- Добавить MEF 9 мл среды для инактивации трипсина. Побочные клеток на 800 оборотов в минуту в течение 3 минут. Осторожно аспирации супернатант и оставить осадок клеток неповрежденной.
- Ресуспендируют клеток в предварительно нагретой 100 мкл человеческих стволовых клеток nucleofector решение, начиная с шага 3.3.
- Передача клетки nucleofector кюветы, используя 1 мл пипетки.
- Добавить 4 мкг плазмидной ДНК в клеточной суспензии в кювете. Смешать клеток и ДНК, закрученной нежный. Нажмите кювет дважды на капот поверхности.
- Вставьте кювету в держатель nucleofector. Использование программы B-016. Nucleofect клетки, нажав на кнопку X.
<
- Получить nucleofected клеток из кюветы, используя предоставленные Пастера пластиковые пипетки. Восстановление клеток ресуспендирования их в предварительно нагретой CM-и рок-ингибитора в стерильный 1,5 мл трубки Эппендорф. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 10 минут, чтобы позволить клеткам восстановиться.
- Передача клетки каплям на фидер слои с помощью 1 мл пипетки. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение ночи.
- Монитор для эффективности трансфекции на следующий день. Для получения стабильных клонов трансгенных человека ИПСК, что стабильно экспрессирующих трансген, изменение средней на следующий день с CM-и рок-ингибитором. Добавить соответствующий антибиотик выбора после 24 - 48 часов.
4. Представитель Результаты:
Discussion
Наши протоколы результатов в простой, надежный и очень воспроизводимые методы внедрения трансгенов в ИПСК человека без выступающих токсический эффект и гибель клеток. ИПСК человека должно быть пассировать на более мелкие скопления клеток (5-10 клеток) и высевают на Geltrex при высокой плотности (1:2) для обеспечения оптимальной эффективности трансфекции в многочисленных небольших колоний. Для человека ИПСК линий, которые являются более склонными к смерти дифференциации и клетки, большее число человеческих токов (до 4 х 10 6 клеток) должны быть использованы для одного эксперимента nucleofection. Переходный анализ трансфекции генерирует большое количество трансгенов, экспрессирующие человеческие ИПСК в течение 1 дня. Стабильно трансфицированные клоны ИПСК обычно появляются в течение 7 дней, и эти трансгенные колонии должны быть готовы быть собраны в течение трех недель. Использование CAG промотор, описанный здесь, обеспечивает повсеместное выражение УЗФБ репортер. В таких улучшений, наши протоколы могут быть поданы в другие приложения, в том числе гиперэкспрессией, сУсловное индукции, вывод линии конкретных репортер линии, ShRNA или миРНК нокдаун, генного таргетинга и гомологичной рекомбинации.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работы, описанные в этой рукописи стало возможным благодаря финансированию из Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) для UCR Core Cell Stem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin with EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 2-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 3 mm glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | Glass beads should be washed with hydrochloric acid (HCl) overnight, rinsed off with sodium hydroxide (NaOH) and distilled water, and sterilized by autoclave before use. |
| Accutase cell dissociation reagent | Invitrogen | A11105-01 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | PHG0263 | |
| DMEM (high glucose) | Lonza Inc. | 12-741 F | |
| Fetal calf serum | Invitrogen | 16000044 | |
| Geltrex | Invitrogen | 12760013 | Growth factor reduced |
| GeneJuice transfection reagent | EMD Millipore | 70967 | |
| Glutamax-I (100X) | Invitrogen | 35050061 | L-Glutamine (Invitrogen, 25030081) can also be used instead. |
| Human iPSC KOSR media | 500 ml human ES media consists of 390 ml KnockOut DMEM/ F12, 100 ml KnockOut Serum Replacer, 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 500 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. | ||
| KnockOut DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | |
| KnockOut Serum Replacement (KOSR) | Invitrogen | 10828-028 | |
| Mouse embryonic fibroblast media | MEF media consists of 90% FBS, 1X NEAA, 1X Glutamax-I and 1X sodium pyruvate in DMEM (high glucose) | ||
| Non essential amino acid, NEAA?(100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| Human stem cell nucleofector solution 1 with supplement | Lonza Inc. | VAPH-5012 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Invitrogen | 10010023 | |
| Sodium pyruvate (100X) | Invitrogen | 11360070 | |
| STEMPRO medium kit | Invitrogen | A1000701 | 500 ml STEMPRO media consists of 454 ml KnockOut DMEM/ F12, 10 ml STEMPRO serum-free growth supplement (50X), 5ml Glutamax-I (100X), 5ml NEAA (100X), 36 ml BSA (Bovine serum albumin, 25%), 909 μl 2-Mercapt–thanol (55mM) and supplemented with 10 ng/ml bFGF. |
References
- Liew, C. G. Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation. Ann Med. 37, 521-532 (2005).
- Eiges, R. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homogous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).
- Siemen, H. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives. Stem Cells. 26, 525-533 (2008).
- Braam, S. R. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
- Braam, S. R. Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification. Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).
- Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).
- Placantonakis, D. G. BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage. Stem Cells. 27, 521-532 (2009).
