Summary
Een
Abstract
De primaire sensorische axonen gewond door spinale wortel verwondingen niet te regenereren in het ruggenmerg, wat leidt tot chronische pijn en blijvende zintuiglijke verlies. Regeneratie van dorsale wortel (DR) axonen in het ruggenmerg wordt voorkomen op de dorsale wortel entry zone (DREZ), de interface tussen het centrale zenuwstelsel en PNS. Ons begrip van de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die regeneratie te voorkomen op DREZ is onvolledig, deels omdat complexe veranderingen die gepaard gaan met een zenuwbeschadiging zijn afgeleid uit post-mortem analyses. Dynamische cellulaire processen, zoals regeneratie van axonen, worden het best bestudeerd met technieken die real-time gebeurtenissen met meerdere waarnemingen van ieder levend dier te vangen. Ons vermogen om neuronen te controleren serieel in vivo is dramatisch toe als gevolg van revolutionaire innovaties in de optica en de muis genetische manipulatie. Verscheidene lijnen van thy1-GFP transgene muizen, waarin de subsets van neuronen genetisch zijn geëtiketteerd in verschillende fluorescerende kleuren, maken individuele neuronen af te beelden in vivo 1. Deze muizen zijn uitgebreid gebruikt voor in vivo beeldvorming van de hersenen de spieren 2-4 en 5-7, en hebben nieuwe inzichten in de fysiologische mechanismen die statische analyses niet konden hebben opgelost. Beeldvormend onderzoek van neuronen in het ruggenmerg wonen nog maar kort geleden begonnen. Lichtman en zijn collega's voor het eerst gedemonstreerd op hun haalbaarheid door het bijhouden van gewonde dorsale kolom (DC) axonen met een wide-field microscopie 8,9. Multi-foton in vivo beeldvorming van diep gepositioneerd DC axonen, heeft microglia en bloedvaten ook bereikt 10. In de afgelopen jaren, hebben wij de pioniers bij de toepassing van in vivo beeldvorming tot regeneratie van axonen DR gebruik van wide-field microscopie en H lijn van thy1-YFP muizen monitor. Deze studies hebben geleid tot een nieuwe hypothese over de reden waarom DR axonen worden verhinderd regenereren in het ruggenmerg 11.
In H lijn van thy1-YFP muizen, zijn te onderscheiden YFP + axonen oppervlakkig geplaatst, die het mogelijk maakt meerdere axonen tegelijk worden gecontroleerd. We hebben geleerd dat DR axonen te komen tot DREZ beter worden afgebeeld in de lumbale dan in cervicale ruggenmerg. In dit rapport beschrijven we een aantal strategieën die we hebben gevonden nuttig om een succesvolle lange termijn en herhaalde beeldvorming van regenererende axonen DR verzekeren. Deze omvatten methoden die herhaald intubatie en respiratoire onderbreking elimineren, minimaliseren van de operatie-geassocieerde stress en littekenvorming, en het verwerven van een stabiele beelden op hoge resolutie zonder fototoxiciteit.
Protocol
1. Microscoop set-up en imaging voorbereiding
- Onze beeldvorming set up bestaat uit een Leica MZ16 fluorescerende stereomicroscoop met een snelle sluiter en een gekoelde CCD-camera bestuurd door Metamorph software.
- Bereid een thermostatisch geregelde verwarming pad en aan te passen vermogen tot 32,5 ° C te houden van het dier lichaamstemperatuur tijdens en na de operatie.
- Warm steriele Ringer-oplossing of kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) tot 32,5 ° C bij voorbaat voor de irrigatie van het ruggenmerg tijdens de operatie.
- Verdoven het dier met een intraperitoneale injectie van xylazine (8 mg / kg) en ketamine (120 mg / kg) cocktail.
- Scheren van de bovenrug met kleine dieren clippers en de verspreiding een kleine druppel van ontharen lotion over het geschoren gebied met wattenstaafje doekjes. Minuten later, verwijder de toegepaste lotion met 70% ethanol gedrenkt gaas sponzen.
2. Laminectomie en chirurgische blootstelling van de dorsale wortel L5
- Leg het dier op een verwarmde (32,5 ° C) pad en desinfecteren van de huid met 70% ethanol doorweekt swabs.
- Onder helderveld verlichting op de stereomicroscoop, voert u een middellijn incisie (2 - tot 3-cm) in de huid van de rug. Gebruik indien nodig wattenstaafje doekjes om het bloeden te stoppen.
- Afspiegeling van de wervelkolom spieren aan de onderliggende lumbale wervels bloot te leggen.
- Expose de L3-S1 spinale segmenten door met de rechter-zijdige hemi-laminectomie met kleine rongeurs. Een gedeeltelijke laminectomie bloot 4-6 segmenten van de lumbale en sacrale ruggenmerg wordt gecreëerd door het verwijderen van de rechter dorsale gedeelte van de wervels L5 op het niveau van de crista iliaca van de heup (locatie van L5 DRG) rostraal aan de wervels L2 (2 wervels caudaal van de laatste rib). Perfuseren de holte met een oplossing warm steriele Ringer's.
- Plaats het dier op een steunkussen (gerold katoen gaas) aan de wervelkolom plat. Gebruik terugtrekken haken aan het blootgestelde gebied te verbreden.
- Op dit punt (ongeveer 30 minuten na de eerste ip injectie van verdoving, een supplement (0.5X) dient subcutaan geïnjecteerd te worden in stand te houden van het dier volledig verdoofd. Alternatief, gas anesthesie (2-4% isofluraan in 0.5L/min zuurstof ) kan worden gebruikt voor herhaalde verdoving tijdens de imaging-sessies langer dan 1 uur.
3. Rhizotomy / dorsale wortel te verpletteren
- Schakel over naar fluorescentie excitatie te visualiseren YFP label (+) axonen.
- Met behulp van de punt van een Sub-Q (26ga.) naald, het uitvoeren van een kleine incisie in de dura bovenliggende het L5 dorsale wortel (DR). Perfuseren herhaaldelijk met Ringer-oplossing en schoon zachtjes met wattenstaafje doekjes.
- Identificeer de site worden verpletterd en steek de ene kant van een fijne pincet (Dumont # 5) subdurally.
- Sluit het pincet voorzichtig maar stevig, houdt de mediale gedeelte van de wortel L5 gedurende 10 seconden, en dan zachtjes laat de tang.
- Was herhaaldelijk met fysiologische oplossing en schone zachtjes met wattenstaafje doekjes.
4. Beeldacquisitie en post-op procedures
- Verkrijgen van meerdere beelden van het hele blootgestelde gebied met inbegrip van de crush site en de DREZ voor en direct na de crush bij zowel lage als hoge vergroting.
- De beelden werden hetzij als afzonderlijke foto's of als meerdere streams van 10 tot 20 frames verworven binnen de 30 - tot 40-ms belichtingstijd. In-focus foto's worden vervolgens geselecteerd, en een overzicht montage wordt gemaakt later met behulp van Photoshop.
- Te minimaliseren littekenvorming, strak toepassen van een stukje dunne synthetische matrix membraan (Biobrane), gevolgd door kunstmatige dura, op de top van de blootgestelde ruggenmerg. Zorg ervoor dat in stukken gesneden om precies te passen in de blootgestelde ruggenmerg venster, zodat ze aanhanger van het ruggenmerg.
- Sluit de spieren met steriele 5-0 hechtingen en sluit de middellijn incisie met gewikkelde clips.
- Injecteer Ringer-oplossing (0.3-tot 0,5-ml subcutaan), en beheren Buprenorfine als postoperatieve analgesie (0,05 mg / kg) subcutaan om 12 uur voor 2 dagen.
- Houd het dier op een verwarmingselement (34 ° -35 ° C) totdat hersteld.
5. Herhaalde beeldvorming
- Verdoven van het dier en verwijder de wond clips en hechtingen.
- Het opheffen van kunstmatige dura en dunne synthetische matrix membraan patches en bewaar ze op in een steriele buis met Ringer's oplossing voor later hergebruik.
- Verwijder eventuele geaccumuleerde bindweefsel litteken met het gebogen uiteinde van een Sub-Q naald en fijne tang. Perfuseren vaak met de oplossing warm Ringer's.
- Opnieuw bloot te leggen van de operatieve gebied, met inbegrip verpletteren site en DREZ, verplaatsen YFP + axonen afgebeeld in vorige sessies, en herhaal de procedures beschreven in hoofdstuk 4.
6. Representatieve resultaten:
Wij hebben geconstateerd dat, terwijl ze niet regenereren na een doorsnijding blessure, bijna alle YFP + axonen groeide via de site vanletsel door 3 dagen na het verpletteren (figuur 1) 11. Typisch, de volgende dag na het pletten, zagen we sterven-back degeneratie van de proximale stomp axonen en versnippering / degeneratie van de axonen dezelfde distaal van de te verpletteren, waarin werd bevestigd dat axonen had behoren beschadigd (bijvoorbeeld figuur 1, dag 3 en 5) . Een aantal aanvullende criteria worden toegepast op ondubbelzinnig regenererende axonen te onderscheiden van axonen die werden gespaard of hadden hersteld van de blessure. Deze omvatten het volgende: (1) regenererende axonen vertonen een uitbreiding van de niet-fluorescerende gedeelte van de YFP + axon op de crush terrein als gevolg van proximale en distale degeneratie (in tegenstelling tot vernauwing van de niet-gelabelde kloof door TL cytoplasma bijvullen van de crush website Als axonen overleefde het letsel), (2) regenererende axonen zijn veel dunner, minder fel tl-licht, en meer dan golvende axons dat de schade overleefd, (3) herstel van neurieten zijn dunner en meer vaag fluorescerende dan de degenererende fluorescerende brokstukken van axonen, waardoor zij uitgebreid; (4) in tegenstelling tot overleven of gespaard axonen, regenererende axonen stoppen bij de DREZ, en (5) in tegenstelling tot overleven of gespaard axonen, regenererende axonen vertonen geen knopen van Ranvier. Figuur 1 toont vier oppervlakkige YFP + axonen direct na het verpletteren (A1; gekleurde pijlen). Drie dagen na de verpletteren, alle vier de axonen te verlengen een neurieten dat groeit door de crush site (A2). Vijf dagen na verpletteren, neurieten stabiel blijven en er is geen extra groei van deze of andere proximale axonen (A3).
Het regenereren neurieten dat de crush website langgerekte door veel dikker en helderder fluorescerende fragmenten van een degenererende axon (dat wil zeggen, endoneurial buizen) overgestoken, en komen op de DREZ al 4 dagen na de crush (ongeveer 3 mm / 2 dagen) 11. Herhaalde beeldvorming van deze axonen en hun tips om de twee of drie dagen voor nog twee weken (figuur 2) bleek dat zij niet naar voren groeien of intrekken, maar bleef onbeweeglijk. De enige merkbare verandering was zwelling van de tips en schachten van een aantal axonen. Deze observaties laten zien dan ook verrassend snel en chronische immobilisatie van de regenererende axonen op de DREZ.
Figuur 1: Herhaalde beeldvorming van L5 DR YFP + axonen op de site van dorsale wortel te verpletteren over 5 dagen. Het mediale deel van de wortel L5 werd neergeslagen (rode pijlpunt) en afgebeeld op de dagen 0, 3 en 5 na de crush. De oppervlakte van het te verpletteren wordt uitvergroot in de juiste panelen (A1-A3).
Figuur 2:. Herhaalde beeldvorming van axonen aangekomen bij de DREZ meer dan 20 dagen na de L5 wortel verpletteren Dag 4, drie axonen (gekleurde pijlen) aangekomen bij de DREZ. De toppen van deze axonen blijven op dezelfde locatie en hebben een soortgelijk uiterlijk in de daaropvolgende beeldvorming sessies op dag 7, 9, 13, 15 en 20. Posities van een axon tip in vergelijking met andere axon tips en bezienswaardigheden (sterretjes) werden gebruikt om de axon beweeglijkheid tussen beeldvorming sessies te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Imaging DR regeneratie direct in levende muizen vormt een bijzondere uitdaging, omdat het een substantiële dorsale laminectomie nodig heeft om axongroei monitoren over een groot gebied, gevolgd door meerdere invasieve chirurgische en anesthetische procedures in de daaropvolgende beeldvorming sessies. Verschillende strategieën geholpen om deze uitdagingen te overwinnen. De eerste, succesvolle beeldvormend onderzoek vereist het verminderen van de muis de mortaliteit (circa 25%) door het minimaliseren van de duur van de anesthesie en bloeden, en door zorgvuldige postoperatieve zorg. De sterfte is eveneens verlaagd, met instellingen die een snelle camera snelheid om snel meerdere foto's te verkrijgen zonder intubatie of respiratoire onderbreking toe te staan. Het voorkomen van opeenhoping litteken op de blootgestelde koord was ook essentieel. Deze collagene littekens ontwikkelen zich snel tussen de beeldvorming sessies en vormen een dunne, maar ondoorzichtige laag op de dura oppervlak. Verwijdering is vervelend, verlengt het beeld sessie en de risico's schade aan bloedvaten en axonen. Een effectieve strategie voor het litteken verwijdering was om een dun membraan dat matrix goed gehandeld op grond van de blootgestelde snoer en veroorzaakte littekens te accumuleren op het membraan in plaats van op de dura toe te passen. Vanwege de mogelijkheid van verstorende effecten als gevolg van artefacten uit chirurgische procedures en photoxicity, voerden we een uitgebreide controle-experimenten waarin we axonale profielen onderzocht in muizen zonder terugkerende beeldvorming of een operatie.
De protocollen maken gebruik van groothoek microscopie met instellingen die de camera snel snelheid en beeldacquisitie mogelijk te maken, zonder intubatie of respiratoire onderbreking. We krijgen meerdere afbeeldingen van oppervlakkige axonen en later kiezen de beste foto's met de minste vervorming als gevolg van ademhalingsbewegingen. Deze methode biedt onvoldoende ruimtelijke resolutie, maar hoewel het maakt het mogelijk om de identificatie en het volgen van de oppervlakkig gelegen DR axonen over een groot gebied: het was onmogelijk om het geheel van meerdere axonen zich in elke imaging sessie hebben, of om duidelijke beelden te verkrijgen van verschillende axon tips tegelijk en herhaaldelijk elke keer.
Ter vergemakkelijking van de identificatie van dezelfde axonen in herhaalde beeldvorming sessies, kan men overwegen gebruik te maken fluorescerende microsfeer kralen (1 uM, Invitrogen) om meer 'monumenten' te creëren, in aanvulling op de intrinsieke degenen (dat wil zeggen, unieke patronen vertakking van de bloedvaten en de aangrenzende axonen) . Zelfs als de groei van tips zijn zeer dynamisch en snel van vorm veranderen, kan men herkennen door hun ouders axon as, die ongewijzigd blijft perifeer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken dr. Alan Tessler voor commentaar en redactionele hulp. Dit werk werd ondersteund door NIH NS062320.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd, Inc. | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira Inc. | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional Products | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co. | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | BD Biosciences | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon Inc. | K-580 | |
| Wound clips | Perfect - Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments, Inc. | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices | ||
| Photoshop | Adobe |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
