Summary

Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

Published: September 01, 2011
doi:

Summary

Bir<em> In vivo</em> Görüntüleme protokolü, dorsal kök ezmek aşağıdaki birincil duyusal aksonlar izlemek için tarif edilir. Prosedürleri geniş alan floresan mikroskopi ve thy1 YFP transgenik fareler kullanan ve akson rejenerasyonu PNS ve akson etkileşimleri CNS arayüzü ile 4 cm üzerinde tekrarlanan görüntüleme izni.

Abstract

Spinal kök yaralanmalar yaralandı primer duyusal aksonlar, kronik ağrı ve kalıcı duyu kaybı, omurilik içine yeniden başarısız olur. Omuriliğe dorsal kök (DR) akson Rejenerasyon dorsal kök giriş bölgesi (DREZ), merkezi sinir sistemi ve PNS arasındaki arayüzü önlenmiş olur. DREZ az rejenerasyon önlemek için moleküler ve hücresel olayların anlayışımız, sinir hasarı ile ilişkili karmaşık değişiklikler, postmortem analizleri sonucuna çünkü kısmen eksik. Akson rejenerasyonu gibi dinamik hücresel süreçleri, en iyi gerçek-zamanlı olarak olaylar her canlı hayvanın çoklu gözlem yakalama teknikleri ile çalıştı. Bizim seri nöronlar in vivo monitör yeteneği, optik ve fare transgenik devrimci yenilikler dramatik nedeniyle artmıştır . Thy1-GFP transgenik farelerin birkaç satır, nöron altkümelerini genetik olarak farklı floresan renkler etiketli olduğu, bireysel nöronlar in vivo 1 imaged izin verecek. Bu fareler, kas, 2-4 ve 5-7 beyin in vivo görüntüleme için yaygın olarak kullanılan ve statik analizler çözülmesi olamayacağını fizyolojik mekanizmaları yeni bakış açıları sağlamıştır . Ancak son zamanlarda yaşayan omurilik nöron görüntüleme çalışmaları başladı. Lichtman ve arkadaşları ilk kez geniş alan mikroskobu 8,9 ile yaralı dorsal kolon (DC) aksonlar takip ederek kendi fizibilite gösterdi. Multi-foton, derin yerleştirilmiş DC akson in vivo görüntüleme mikroglia ve kan damarlarının 10 başarılı olmuştur. Son birkaç yıl içinde, biz geniş alan mikroskobu ve thy1-YFP farelerin Y hattı kullanılarak DR akson rejenerasyonu izlemek için in vivo görüntüleme uygulanmasında öncülük etmiştir. Bu çalışmalar 11 omurilik içinde DR aksonlar rejenere engellenir neden hakkında bir roman hipotez için bize yol açmıştır.

Thy1-YFP farelerin Y doğrultusunda, farklı YFP + aksonlar yüzeysel birkaç aksonlar eş zamanlı olarak takip edilmesine olanak sağlamaktadır konumlandırılmış. Biz DREZ gelen DR aksonlar daha iyi servikal spinal kord daha lomber imaged olduğunu öğrendim. Bu raporda biz yenileyici DR akson başarılı uzun süreli ve tekrarlanan görüntüleme sağlamak için yararlı bulduk çeşitli stratejiler açıklanmaktadır. Bunlar tekrarlanan entübasyon ve solunum kesintisi ortadan kaldırmak yöntemleri, cerrahi ile ilişkili stres ve skar oluşumu en aza indirmek ve fototoksisite olmadan istikrarlı yüksek çözünürlükte görüntüler elde edin.

Protocol

1. Mikroskop kurmak ve görüntüleme hazırlık Bizim görüntüleme, bir hızlı çekim ve soğutmalı CCD kamera Metamorph yazılımı tarafından kontrol edilen bir Leica MZ16 floresan stereomikroskopta oluşur ayarlayın. Termostatik kontrollü bir ısıtma yastığı hazırlayın ve 32,5 ° C, hayvanın vücut ısısını korumak için sırasında ve cerrahi sonrası çıkış ayarlayabilirsiniz. 32,5 ° C, ameliyat sırasında omurilik sulama için önceden Sıcak steril Ringer sol?…

Discussion

Doğrudan yaşayan fareler Görüntüleme DR rejenerasyon özellikle sonraki görüntüleme oturumlarda birden fazla invaziv cerrahi ve anestezi prosedürleri takip geniş bir alana akson büyümesini izlemek için önemli bir dorsal laminektomi gerektirdiğinden zordur. Çeşitli stratejiler, bu zorlukların üstesinden gelmek için yardımcı oldu. İlk olarak, başarılı bir görüntüleme, anestezi ve kanama süresini en aza indirmek fare mortalite (yaklaşık% 25) azaltılması gereklidir ve titiz post-op bakım. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr Alan Tessler yorum ve editoryal yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü, NS062320 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) 003782  
Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) 4811 8 mg/kg
Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) Hospira, Inc. (Lake Forest, IL) 2051 120 mg/kg
Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.(Richmond, VA) 7571  
Small animal hair clippers Oster Professional, (McMinnville, TN) 76059-030  
Hair removal lotion Church & Dwight Co (Princeton, NJ) NAIR with Baby Oil  
Gauze sponges Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) 22-362-173  
Cotton-tipped swabs Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) 14-960-3Q  
1 mL syringes Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, NJ) 309602  
Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. Becton, Dickson and Company (Franklin Lakes, NJ) 305115  
Spring scissors and forceps Fine Science Tools, (Foster City, CA)    
2.5-mm curved rongeurs Fine Science Tools, (Foster City, CA) 16221-14  
Lactated Ringer’s Injection USP B. Braun Medical Inc., (Irvine, CA) BBR-L7502  
Sterile saline solution APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) 918610  
Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) 62794-096-251  
Artificial dura Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) 1MVP40  
5-0 silk sutures Ethicon, Inc. (Somerville, NJ) K-580  
Wound clips Perfect – Ets Bruneau, (Burnea, France) A75  
Fluorescent stereomicroscope Leica Microsystems, (Wetzlar, Germany) MZ16  
CCD camera Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) ORCA-Rx2  
Temperature Controller World Precision Instruments (Sarasota, FL) ATC 1000  
Metamorph software Molecular Devices, (Sunnyvale, CA)    
Photoshop Adobe Systems, San Jose, CA    

References

  1. Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  2. Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
  3. Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
  4. Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
  5. Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  6. Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
  7. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
  8. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
  9. Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
  10. Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
  11. Maio, D. D. i. in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).

Play Video

Cite This Article
Skuba, A., Himes, B. T., Son, Y. Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy. J. Vis. Exp. (55), e3126, doi:10.3791/3126 (2011).

View Video