Summary
Abstract
אקסונים חושית העיקרי שנפגע פציעות שורש השדרה מצליחים להתחדש אל חוט השדרה, הגורם לכאב כרוני אובדן חושים קבע. התחדשות של הגב (DR) אקסונים שורש לתוך חוט השדרה הוא מנע בכניסה לאזור הגב שורש (דח), ממשק בין מערכת העצבים המרכזית ואת PNS. ההבנה שלנו את האירועים מולקולרית תאית למנוע התחדשות ב דח אינו שלם, בין השאר בשל שינויים מורכבים הקשורים פגיעה עצבית כבר להסיק ניתוחים שלאחר המוות. תהליכים תאיים דינמי, כגון התחדשות האקסון, נלמדים בצורה הטובה ביותר עם טכניקות ללכוד בזמן אמת אירועים עם תצפיות מרובות של כל חיה חיים. היכולת שלנו לפקח על נוירונים סדרתי in vivo גדל באופן דרמטי עקב חידושים מהפכניים באופטיקה ועכבר transgenics. כמה שורות של thy1-GFP העכברים הטרנסגניים, שבו תת נוירונים מסומנים בצבעי ניאון גנטית ברורה, היתר נוירונים בודדים להיות צילמו in vivo 1. עכברים אלו היו בשימוש נרחב בתחום ההדמיה vivo של השרירים והמוח 2-4 5-7, וגם סיפקו תובנות הרומן לתוך המנגנונים הפיזיולוגיים מנתח סטטי לא יכול להיות נפתרה. מחקרי הדמיה של נוירונים בחוט השדרה החיים החלו רק לאחרונה. ליכטמן ועמיתיו הראשון הפגינו ההיתכנות שלהם על ידי מעקב אחר נפצע הגבי (DC) אקסונים טור עם מיקרוסקופיה רחב בתחום 8,9. Multi-פוטון בתחום ההדמיה vivo של אקסונים ממוקם עמוק DC, microglia וכלי דם גם הושג 10. במהלך השנים האחרונות, יש לנו חלוץ ביישום בתחום ההדמיה vivo לפקח התחדשות של אקסונים DR שימוש רחב בתחום מיקרוסקופיה קו H של thy1-YFP עכברים. מחקרים אלו הובילו אותנו להשערה רומן על למה אקסונים DR מנועים התחדשות בתוך חוט השדרה 11.
בשורה של H-thy1 YFP עכברים, להבדיל YFP אקסונים + ממוקמים שטחית, אשר מאפשר אקסונים מספר לנטר בו זמנית. למדנו כי אקסונים DR להגיע דח הם צילמו המותני טוב יותר מאשר בחוט השדרה הצווארי. בדו"ח הנוכחי אנו מתארים מספר אסטרטגיות שמצאנו שימושי כדי להבטיח הדמיה לטווח ארוך וחזר מוצלח של אקסונים התחדשות DR. אלה כוללים שיטות לחסל אינטובציה חוזרים ונשנים הפרעה נשימתית, למזער ניתוח הקשורים מתח היווצרות צלקת, לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה ויציבה ללא phototoxicity.
Protocol
1. מיקרוסקופ להגדיר הכנה הדמיה
- ההדמיה שלנו להגדיר מורכב stereomicroscope לייקה MZ16 ניאון עם תריס מהיר מצלמה מקורר CCD נשלט על ידי תוכנה Metamorph.
- הכנת כרית חימום מבוקר תרמוסטטית ולהתאים את הפלט 32.5 ° C כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים במהלך לאחר הניתוח.
- רינגר סטרילי חם של פתרון מלאכותי או הנוזל השדרתי (ACSF) ל 32.5 מעלות צלזיוס מראש להשקיה של עמוד השדרה במהלך הניתוח.
- להרדים את החיה עם זריקה intraperitoneal של xylazine (8 מ"ג / ק"ג) ו קטמין (120 מ"ג / ק"ג) קוקטייל.
- לגלח את הגב העליון עם קוצץ חיה קטנה ולהפיץ טיפה אחת קטנה של קרם להסרת שיער על האזור המגולח עם כותנה שקצהו מטליות. דקות לאחר מכן, להסיר את קרם מיושם באמצעות 70% אתנול ספוג ספוגים גזה.
2. Laminectomy וחשיפה כירורגית של השורש הגבי L5
- מניחים את חיה על מחוממת (32.5 ° C) פנקס לחטא את העור עם מטליות אתנול 70% ספוג.
- תחת תאורה בשדה בהיר על stereomicroscope, לבצע חתך קו האמצע (2 - 3 ס"מ) בעור של הגב. במידת הצורך, להשתמש כותנה שקצהו מטליות כדי לעצור את הדימום.
- לשקף את שרירי עמוד השדרה כדי לחשוף את החוליה המותנית הבסיסית.
- לחשוף את L3-S1 קטעים השדרה באמצעות לחצן העכבר הימני צדדי חמי laminectomy rongeurs קטן. Laminectomy חלקית חשיפת 4-6 קטעים של חוט השדרה המותני ואת העצה נוצרת על ידי הסרת החלק הגבי הימני של החוליות L5 ברמה של רכס הכסל של הירך (המיקום של DRG L5) rostrally את חוליות L2 (2 חוליות הזנב אל הצלע האחרונה). Perfuse חלל עם פתרון Ringer סטרילי חם.
- מקם את חיה על כרית תמיכה (גזה כותנה מגולגל) למעוך את עמוד השדרה. השתמש ווים נסיגת להרחיב את השטח חשוף.
- בשלב זה (כ 30 דקות לאחר ההזרקה ip הראשון של הרדמה, תוסף (0.5X) צריך להיות מוזרק תת עורי על מנת לשמור על החיה בהרדמה מלאה. לחילופין, גז הרדמה (2-4% isoflurane חמצן 0.5L/min ) יכול לשמש הרדמה חוזרות ונשנות במהלך הפגישות הדמיה יותר משעה 1.
3. Rhizotomy / למחוץ השורש הגבי
- עבור עירור הקרינה לדמיין YFP שכותרתו (+) אקסונים.
- משתמש קצה של מחט (26ga.) Sub-Q, מבצעים חתך קטן של הדורה המכסה את השורש הגבי L5 (DR). Perfuse שוב ושוב עם הפתרון של רינגר ולנקות בעדינות עם צמר גפן שקצהו מטליות.
- זהה את האתר להימחץ והכנס צד אחד של מלקחיים קנס (דומון # 5) subdurally.
- סגור את מלקחיים בעדינות אך בתקיפות, מחזיק את החלק המדיאלי של שורש L5 למשך 10 שניות, ולאחר מכן משחררים בעדינות את מלקחיים.
- לשטוף שוב ושוב עם פתרון פיזיולוגי ולנקות בעדינות עם צמר גפן שקצהו מטליות.
4. תמונה הרכישה מנותחות נהלים
- קבל מספר תמונות של האזור כולו חשוף כולל האתר למחוץ את דח לפני ומיד אחרי לרסק את בהגדלה הן נמוך וגבוה.
- תמונות נרכשים או כמו תמונות בודדות או כמו מספר זרמים של 10 עד 20 מסגרות רכש בתוך 30 - ל 40-ms זמן החשיפה. In-להתמקד תמונות נבחרות אז, מונטאז' סקירה נוצר מאוחר יותר באמצעות Photoshop.
- כדי למזער היווצרות צלקת, בחוזקה להחיל פיסת קרום דק מטריצה סינתטי (Biobrane), ואחריו הדורה מלאכותי, על גבי עמוד השדרה חשוף. הקפידו לחתוך לחתיכות כדי להתאים בדיוק בחלון חשף את חוט השדרה, כך הם חסיד אל חוט השדרה.
- סגור את השרירים עם 5-0 תפרים סטרילי וסגור את החתך קו האמצע עם קליפים הפצע.
- הזרק הפתרון של רינגר (0.3-ל 0.5-מ"ל תת עורי), ולנהל עצירות כמו שיכוך כאבים לאחר הניתוח (0.05 מ"ג / ק"ג) תת עורי כל 12 שעות למשך 2 ימים.
- שמור את החיה על כרית חימום (34 ° -35 ° C) עד התאושש.
5. חוזרים הדמיה
- להרדים את החיה להסיר את הסרטונים הפצע ותפרים.
- הסר הדורה מלאכותיים סינתטיים קרום דק טלאים מטריצה ולשמור אותם בתוך שפופרת סטרילית המכילה הפתרון של רינגר לשימוש במועד מאוחר יותר.
- להסיר בעדינות את הרקמה החיבורית כל שנצבר צלקת עם קצה של מחט כפוף Sub-Q ו מלקחיים בסדר. Perfuse לעתים קרובות פתרון Ringer חם.
- Re-לחשוף את שדה הניתוח, כולל אתר לרסק דח, להעביר YFP + אקסונים צילמו בפגישות הקודמות, לחזור לנוהל המתואר בסעיף 4.
6. נציג התוצאות:
ראינו כי, בעוד הם לא להתחדש לאחר פציעה חיתוך רוחב, כמעט כל האקסונים + YFP גדל דרך האתר שלפציעה של 3 ימים לאחר למחוץ (איור 1) 11. בדרך כלל, למחרת אחרי למעוך, צפינו גוסס גב לניוון של אקסונים גדם הפרוקסימלי ופיצול / לניוון של אקסונים אותו דיסטלי לרסק, אשר אישר כי אקסונים שניזוקו כראוי (למשל, איור 1; יום 3 ו 5) . קריטריונים נוספים מספר מוחלים להבחין באופן חד משמעי אקסונים התחדשות של אקסונים כי ניצלו או התאושש מהפציעה. אלה כללו את הדברים הבאים: (1) אקסונים התחדשות להראות הרחבה של החלק הלא ניאון של YFP + האקסון באתר למחוץ בשל ניוון הפרוקסימלית ומ דיסטלי (בניגוד וצמצום הפער ללא תווית עקב הציטופלסמה פלורסנט למילוי באתר למחוץ אם אקסונים שרד את הפציעה), (2) אקסונים התחדשות הם הרבה יותר רזה, פחות ניאון בהירים, ואת גלית יותר אקסונים אשר שרדו את הפגיעה, (3) neurites התחדשות הם דקים יותר מאשר פלורסנט במעומעם את שברי המתנוונת הניאון של אקסונים שדרכו הם המורחבת; (4) בניגוד לשרוד או חס אקסונים, אקסונים התחדשות להפסיק את דח; ו (5) בניגוד לשרוד או חס אקסונים, אקסונים התחדשות אינם מציגים צמתים של Ranvier. איור 1 מראה ארבעה שטחי + YFP אקסונים מיד לאחר למחוץ (A1; חצים צבעוניים). שלושה ימים לאחר לרסק את כל ארבעת האקסונים להרחיב neurite יחיד שגדל דרך האתר למחוץ (A2). חמישה ימים לאחר למעוך, neurites להישאר יציב ואין צמיחה נוספת אקסונים אלו או אחרות הפרוקסימלי (A3).
Neurites התחדשות שחצתה את האתר למחוץ מוארך דרך רסיסי פלורסנט הרבה יותר עבה ובהיר של האקסון מתנוונת (כלומר, צינורות endoneurial), ולהגיע מוקדם ככל דח 4 ימים לאחר למחוץ (כ 3mm / 2 ימים) 11. הדמיה חוזרות של אקסונים אלו וטיפים שלהם בכל יומיים או שלושה במשך שבועיים נוספים (איור 2) עולה כי הם לא גדלים קדימה או לסגת, אבל נותרו חתומות. השינוי היחיד היה מורגש נפיחות של טיפים אלומות של אקסונים מסוימים. תצפיות אלו ולכן להפגין immobilization מהיר מפתיעה כרונית של אקסונים התחדשות ב דח.
איור 1: הדמיה חוזרות של L5 DR YFP + אקסונים באתר למחוץ השורש הגבי מעל 5 ימים. החלק המדיאלי של שורש L5 נמחץ (חץ אדום) ואת הדמיה על 0 ימים, 3 ו 5 אחרי הדוחק. האזור של לרסק את מוגדל של לוחות ימינה (A1-A3).
איור 2:. הדמיה חוזרות ונשנות של אקסונים הגיעו דח מעל 20 ימים לאחר לרסק שורש L5 יום 4, שלושה אקסונים (חיצים בצבע) הגיעו דח. קצות אקסונים אלה להישאר באותו מקום ויש להם מראה דומה בפגישות הבאות הדמיה על 7 ימים, 9, 13, 15, 20. עמדות קצה האקסון יחסית טיפים האקסון אחרים ציוני דרך (כוכביות) שימשו כדי לקבוע תנועתיות האקסון בין הפגישות הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה DR התחדשות ישירות בעכברים החיים מאתגרת במיוחד, מכיוון שהיא דורשת laminectomy הגב כדי לפקח על צמיחה משמעותית האקסון פני שטח נרחב ואחריו מספר ניתוחים והוא הרדמה פולשנית הדמיה בפגישות הבאות. כמה אסטרטגיות סייעה להתגבר על אתגרים אלה. הדמיה ראשית, מוצלח נדרש צמצום תמותת העכבר (כ 25%) על ידי צמצום משך הרדמה דימום, ועל ידי טיפול מנותחות מוקפד. התמותה הופחת גם באמצעות הגדרות המאפשרים מהירות המצלמה מהר מהר לרכוש מספר רב של תמונות ללא אינטובציה או הפרעה בדרכי הנשימה. מניעת הצטברות צלקת על חוט חשוף גם חיוני. אלה צלקות collagenous לפתח במהירות בין הפגישות הדמיה טופס שכבה דקה אבל אטום על פני השטח הדורה. הסרת משעמם, מאריכה את הפגישה תמונה והסיכונים נזק בכלי הדם ואת האקסונים. אסטרטגיה יעילה להסרת הצלקת היה להחיל קרום דק מטריקס כי דבק חזק כבל חשוף וגרם צלקות לצבור על הממברנה ולא על הדורה. בגלל פוטנציאל תופעות בלבול בשל ממצאים מתוך ניתוחים ו photoxicity, ביצענו ניסויים שליטה נרחבת שבה בדקנו פרופילים axonal בעכברים ללא הדמיה חוזרות או ניתוח.
פרוטוקולים לנצל מיקרוסקופיה widefield עם הגדרות המאפשרות מהירות המצלמה מהירה רכישת התמונה, ללא אינטובציה או הפרעה בדרכי הנשימה. אנו לרכוש מספר רב של תמונות של אקסונים שטחית ולאחר מכן לבחור את התמונות הטובות ביותר עם העיוות לפחות בשל תנועות נשימה. שיטה זו מספקת רזולוציה מרחבית לא מספיק, לעומת זאת, אם כי הוא מאפשר זיהוי מעקב קל של אקסונים ממוצבת באופן שטחי DR פני שטח נרחב: אי אפשר היה לקיים את מכלול אקסונים רבים התמקדו בכל פגישה הדמיה, או כדי להשיג תמונות ברורות של מספר האקסון טיפים בו זמנית שוב ושוב בכל פעם.
כדי להקל על זיהוי של אקסונים אותו בפגישות הדמיה חוזרות ונשנות, אפשר לשקול שימוש חרוזים microsphere ניאון (1μm, Invitrogen) כדי ליצור יותר "ציוני דרך", בנוסף על אלה מהותי (כלומר, דפוסי הסתעפות ייחודי של כלי הדם הסמוכים אקסונים) . גם אם טיפים הצמיחה הם דינמיים מאוד לשנות צורה במהירות, אפשר לזהות אותם על ידי פיר האקסון ההורים שלהם, אשר נותר ללא שינוי שולי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים ד"ר אלן טסלר הערות ולעזור העריכה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NS062320.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd, Inc. | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira Inc. | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional Products | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co. | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | BD Biosciences | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon Inc. | K-580 | |
| Wound clips | Perfect - Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments, Inc. | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices | ||
| Photoshop | Adobe |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
