Summary
एक
Protocol
1. माइक्रोस्कोप की स्थापना की और इमेजिंग तैयारी
- हमारे इमेजिंग सेट एक तेजी से शटर और एक ठंडा सीसीडी कैमरा Metamorph सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित के साथ एक Leica MZ16 फ्लोरोसेंट stereomicroscope के होते हैं.
- एक thermostatically नियंत्रित हीटिंग पैड तैयार है और 32.5 करने के लिए डिग्री सेल्सियस जानवर के शरीर का तापमान बनाए रखने के दौरान और सर्जरी के बाद उत्पादन को समायोजित.
- गर्म बाँझ घंटी है या 32.5 ° रीढ़ की हड्डी की सर्जरी के दौरान सिंचाई के लिए अग्रिम में सी कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) समाधान.
- Xylazine (8 मिलीग्राम / किग्रा) और ketamine (120 मिलीग्राम / किग्रा) कॉकटेल के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ पशु anesthetize.
- छोटे जानवर कतरनी के साथ ऊपरी वापस दाढ़ी और बालों को हटाने लोशन के मुंडा क्षेत्र पर एक छोटे ड्रॉप कपास इत्तला दे दी swabs के साथ फैल गया. मिनट बाद, लागू लोशन 70% इथेनॉल लथपथ धुंध स्पंज का उपयोग कर हटा दें.
2. Laminectomy और L5 पृष्ठीय रूट की शल्य चिकित्सा जोखिम
- एक गर्म (32.5 डिग्री सेल्सियस) पैड पर पशु प्लेस और 70% इथेनॉल लथपथ swabs के साथ त्वचा कीटाणुरहित.
- पीठ की त्वचा में stereomicroscope पर उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत, एक midline चीरा प्रदर्शन (3 सेमी 2). यदि आवश्यक हो, कपास इत्तला दे दी swabs का उपयोग रक्तस्राव को रोकने.
- रीढ़ की हड्डी के लिए अंतर्निहित काठ कशेरुकाओं का पर्दाफाश मांसलता दर्शाते हैं.
- सही तरफा HEMI laminectomy छोटे rongeurs का उपयोग करके L3-S1 रीढ़ की हड्डी खंडों को बेनकाब. एक आंशिक काठ का और धार्मिक रीढ़ की हड्डी के 4-6 क्षेत्रों उजागर laminectomy rostrally L2 कशेरुकाओं (2 करने के लिए कूल्हे के श्रोणिफलक शिखा के स्तर पर L5 कशेरुकाओं के सही पृष्ठीय भाग (L5 DRG का स्थान) को हटाने के द्वारा बनाई गई है कशेरुकाओं पिछले रिब दुम). गर्म बाँझ घंटी है समाधान के साथ गुहा Perfuse.
- एक समर्थन तकिया (लुढ़का कपास धुंध) पर पशु स्थिति कशेरुका स्तंभ समतल. त्याग हुक का प्रयोग उजागर क्षेत्र को चौड़ा.
- इस बिंदु (चतनाशून्य करनेवाली औषधि के पहले आईपी इंजेक्शन के बाद लगभग 30 मिनट में, एक पूरक (0.5X) subcutaneously इंजेक्शन होना चाहिए क्रम में करने के लिए पशु पूरी तरह anesthetized रखने के लिए. वैकल्पिक रूप से, गैस संज्ञाहरण (0.5L/min ऑक्सीजन में 2-4 isoflurane% ) इमेजिंग सत्र 1 घंटे से अब के दौरान दोहराया anesthetization के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
3. Rhizotomy / पृष्ठीय रूट क्रश
- कल्पना करने के लिए YFP (+) लेबल axons प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए स्विच.
- एक सुई उप - क्यू (26ga.) के टिप का उपयोग करना, dura में एक छोटा सा चीरा L5 पृष्ठीय रूट (डा.) overlying करते हैं. बार बार घंटी समाधान के साथ Perfuse और कपास इत्तला दे दी swabs के साथ धीरे साफ.
- कुचल दिया जा साइट को पहचानें और एक ठीक संदंश के एक तरफ सम्मिलित (# 5 Dumont) subdurally.
- संदंश बंद धीरे लेकिन दृढ़ता से, 10 सेकंड के लिए L5 जड़ की औसत दर्जे का भाग धारण, और फिर धीरे संदंश रिलीज.
- शारीरिक समाधान के साथ बार - बार धोने और साफ कपास इत्तला दे दी swabs के साथ धीरे.
4. छवि के अधिग्रहण और बाद सेशन प्रक्रियाओं
- कुचलने और पहले और सही दोनों कम और उच्च वृद्धि पर कुचलने के बाद DREZ साइट सहित पूरे उजागर क्षेत्र के एकाधिक छवियों को प्राप्त करते हैं.
- छवियाँ या तो एकल फोटो के रूप में या 10 से 20 फ्रेम के भीतर 30 अधिग्रहीत की कई धाराओं के रूप में अर्जित कर रहे हैं - 40-एमएस जोखिम समय के लिए. ध्यान छवियों तो, चयनित हैं, और एक सिंहावलोकन असेंबल बाद फ़ोटोशॉप का उपयोग कर बनाया है.
- निशान गठन को कम करने के लिए, कस उजागर रीढ़ की हड्डी के शीर्ष पर पतली सिंथेटिक मैट्रिक्स झिल्ली (Biobrane) का एक टुकड़ा, कृत्रिम dura द्वारा पीछा किया, लागू. टुकड़े काट उजागर रीढ़ की हड्डी विंडो में ठीक से फिट इतना है कि वे रीढ़ की हड्डी के अनुयायी हैं सुनिश्चित करें.
- बाँझ 5-0 sutures के साथ बंद मांसलता और घाव क्लिप के साथ midline चीरा बंद.
- घंटी का समाधान (0.5 एमएल 0.3 करने के लिए subcutaneously) इंजेक्षन, और पश्चात analgesia (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) subcutaneously 2 दिनों के लिए हर 12 घंटे के रूप में buprenorphine प्रशासन.
- एक हीटिंग पैड (34 -35 ° ° सी) जब तक बरामद पर पशु रखें.
5. दोहराया इमेजिंग
- पशु anesthetize और घाव क्लिप और sutures को हटा दें.
- कृत्रिम dura और पतली सिंथेटिक मैट्रिक्स झिल्ली पैच निकालें और उन्हें बाद में पुन: उपयोग करने के लिए एक बाँझ घंटी समाधान युक्त ट्यूब में रखना.
- धीरे उप क्यू एक सुई और ठीक संदंश तुला टिप के साथ किसी भी जमा संयोजी ऊतक निशान हटा दें. गर्म घंटी समाधान के साथ अक्सर Perfuse.
- क्रश साइट और DREZ सहित सहकारी क्षेत्र, पुनः बेनकाब, YFP + पिछले सत्र में imaged axons स्थानांतरित करना, और धारा 4 में वर्णित प्रक्रिया को दोहराएँ.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
हमने देखा है कि, जबकि वे एक transection चोट के बाद पुनर्जीवित नहीं किया, लगभग सभी YFP + axons की साइट के माध्यम से बढ़ी3 दिन के द्वारा कुचलने के बाद चोट (चित्रा 1) 11 . आमतौर पर, कुचलने के बाद अगले दिन, हम प्रॉक्सिमल स्टंप axons और विखंडन / उसी को कुचलने के लिए बाहर का axons है, जो पुष्टि की है कि axons उचित क्षतिग्रस्त किया गया था के अध: पतन के मरने वापस अध: पतन मनाया (जैसे, चित्रा 1, 3 दिन और 5) . कई अतिरिक्त मापदंड असंदिग्ध रूप से axons कि बख्शा या चोट से उबर थे से regenerating axons भेद करने के लिए लागू कर रहे हैं. ये निम्नलिखित शामिल हैं: (1) regenerating axons गैर फ्लोरोसेंट YFP के हिस्से का एक विस्तार + कुचलने प्रॉक्सिमल और बाहर का अध: पतन (unlabeled अंतराल के संकुचन के कारण फ्लोरोसेंट कुचलने साइट refilling के cytoplasm के विपरीत में कारण साइट पर अक्षतंतु दिखाने अगर axons चोट बच), (2) regenerating axons बहुत पतली हैं, कम चमकीले फ्लोरोसेंट, और अधिक axons कि चोट बच की तुलना में undulating, (3) regenerating के neurites पतले और अधिक dimly axons की degenerating फ्लोरोसेंट टुकड़े से फ्लोरोसेंट हैं जिसके माध्यम से वे बढ़ाया, (4) के लिए जीवित या बख्शा axons विपरीत में, regenerating axons DREZ पर रोक, और (5) के लिए जीवित या बख्शा axons विपरीत में, regenerating axons Ranvier के नोड्स नहीं एक्ज़िबिट. चित्रा 1 में चार को कुचलने के तुरंत बाद सतही YFP + axons (, रंग तीर A1) दिखाता है. कुचलने के बाद तीन दिन, सभी चार axons एक एकल neurite कि कुचलने साइट (A2) के माध्यम से बढ़ता है विस्तार. कुचलने के बाद पांच दिनों, neurites स्थिर रहते हैं और वहाँ इन या अन्य प्रॉक्सिमल axons (A3) से कोई अतिरिक्त वृद्धि है.
regenerating के neurites कि क्रश एक degenerating अक्षतंतु (यानी, endoneurial ट्यूबों) की बहुत मोटा है और उज्जवल फ्लोरोसेंट टुकड़ों के माध्यम से लम्बी साइट को पार कर, और 4 दिनों के रूप में जल्दी के रूप में DREZ कुचलने के बाद (के बारे में 3mm / 2 दिन) 11 पहुंचें. इन axons और उनके सुझावों को दो सप्ताह (चित्रा 2) के लिए हर दो या तीन दिन के बार - बार इमेजिंग से पता चला है कि वे आगे नहीं बढ़ने किया है या वापस लेना है, लेकिन स्थिर बनी रही. केवल महत्त्वपूर्ण बदलाव युक्तियाँ और शाफ्ट के कुछ axons की सूजन थी. इसलिए इन टिप्पणियों DREZ में regenerating axons की आश्चर्यजनक जल्दी और पुरानी स्थिरीकरण प्रदर्शित करता है.
चित्रा 1: L5 5 दिनों में डॉ YFP + पृष्ठीय रूट को कुचलने की साइट पर axons की इमेजिंग दोहराया. L5 जड़ की औसत दर्जे का भाग (लाल arrowhead) कुचल दिया था और 0 दिन, 3, और 5 कुचलने के बाद पर imaged. कुचलने के क्षेत्र में सही पैनल (A1: A3) में बढ़ाया है .
चित्रा 2: axons की दोहराया इमेजिंग L5 जड़ को कुचलने के बाद 20 दिनों से अधिक DREZ पर पहुंचे 4 दिन, तीन axons (रंग तीर) DREZ पर पहुंचे. इन axons की युक्तियों के एक ही स्थान में रहते हैं और बाद इमेजिंग सत्र में 7 दिन, 9, 13, 15, और 20 पर एक समान रूप है. एक अक्षतंतु अन्य अक्षतंतु सुझावों और स्थलों (तारांकनों) के सापेक्ष टिप के पदों के लिए इमेजिंग सत्र के बीच अक्षतंतु गतिशीलता का निर्धारण किया गया.
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Discussion
इमेजिंग डॉ उत्थान रहने वाले चूहों में सीधे विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह एक पर्याप्त पृष्ठीय laminectomy बाद इमेजिंग सत्र में एकाधिक इनवेसिव शल्य चिकित्सा और चतनाशून्य करनेवाली औषधि प्रक्रियाओं के द्वारा पीछा किया एक विस्तृत क्षेत्र पर अक्षतंतु विकास की निगरानी की आवश्यकता है. कई रणनीतियों को इन चुनौतियों से उबरने में मदद की. पहले, सफल इमेजिंग संज्ञाहरण और खून बह रहा है की अवधि कम से कम माउस मृत्यु दर (लगभग 25%) को कम करने की आवश्यकता है, और सावधानीपूर्वक देखभाल के बाद सेशन द्वारा. मृत्यु दर भी है कि तेजी से कैमरे के लिए जल्दी इंटुबैषेण या सांस की रुकावट के बिना एकाधिक छवियों के अधिग्रहण की गति की अनुमति सेटिंग्स का उपयोग से कम हो गया था. उजागर रस्सी पर निशान संचय की रोकथाम भी आवश्यक था. ये collagenous निशान इमेजिंग सत्र के बीच तेजी से विकसित और dura सतह पर एक पतली लेकिन अपारदर्शी परत फार्म. हटाना कठिन है, छवि सत्र prolongs और vasculature और axons को नुकसान जोखिम. निशान हटाने के लिए एक प्रभावी रणनीति के एक पतली मैट्रिक्स झिल्ली है कि कसकर उजागर की हड्डी का पालन और निशान झिल्ली पर बजाय dura पर जमा करने के लिए कारण लागू किया गया था. Confounding शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं और photoxicity से कलाकृतियों की वजह से प्रभाव के लिए संभावित कारण है, हम व्यापक नियंत्रण प्रयोगों में जो हम चूहों में दोहराव इमेजिंग या सर्जरी के बिना axonal प्रोफाइल की जांच किया.
प्रोटोकॉल है कि तेजी से कैमरे की गति और छवि के अधिग्रहण की अनुमति सेटिंग्स के साथ इंटुबैषेण या सांस की रुकावट के बिना widefield माइक्रोस्कोपी का उपयोग. हम सतही axons की एकाधिक छवियों के अधिग्रहण और बाद में कम से कम साँस लेने आंदोलनों के कारण विरूपण के साथ सबसे अच्छा चित्र का चयन करें. इस विधि अपर्याप्त स्थानिक संकल्प प्रदान करता है, तथापि, हालांकि यह आसान और अल्पज्ञता तैनात एक व्यापक क्षेत्र पर डॉ axons की पहचान और ट्रैकिंग परमिट: यह असंभव था एकाधिक प्रत्येक इमेजिंग सत्र में ध्यान केंद्रित axons की संपूर्णता है, या करने के लिए कई स्पष्ट चित्र प्राप्त अक्षतंतु एक साथ और बार बार हर बार सुझाव.
दोहराया इमेजिंग सत्र में ही axons की पहचान की सुविधा के लिए, एक फ्लोरोसेंट microsphere मोतियों का उपयोग (1μm, Invitrogen) अधिक 'स्थलों' बनाने के लिए, आंतरिक लोगों के लिए इसके अलावा में (यानी, रक्त वाहिकाओं और आसन्न axons की अनूठी शाखाओं में बंटी पैटर्न) पर विचार कर सकते हैं . यहां तक कि अगर विकास सुझावों अत्यंत गतिशील और बदल आकार जल्दी कर रहे हैं, उनमें से एक उनके पैतृक अक्षतंतु शाफ्ट, जो peripherally अपरिवर्तित बनी हुई है के द्वारा की पहचान कर सकते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम टिप्पणी और संपादकीय मदद के लिए धन्यवाद डा. एलन Tessler. यह काम एनआईएच NS062320 द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd, Inc. | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira Inc. | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional Products | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co. | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | BD Biosciences | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon Inc. | K-580 | |
| Wound clips | Perfect - Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments, Inc. | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices | ||
| Photoshop | Adobe |
References
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