Summary
Un
Abstract
Gli assoni sensoriali primarie ferito da lesioni radice spinale non riescono a rigenerarsi nel midollo spinale, con conseguente dolore cronico e permanente perdita di sensibilità. Rigenerazione della radice dorsale (DR) assoni nel midollo spinale è impedito l'ingresso in zona dorsale principale (DREZ), l'interfaccia tra il SNC e SNP. La nostra comprensione degli eventi molecolari e cellulari che impediscono la rigenerazione a DREZ è incompleta, in parte perché i cambiamenti complessi associati a danno del nervo sono stati dedotti dalle analisi post-mortem. Dinamica dei processi cellulari, come la rigenerazione degli assoni, sono i migliori studiati con tecniche che catturano eventi in tempo reale con le osservazioni più di ogni animale vivente. La nostra capacità di monitorare i neuroni in serie in vivo, è aumentato drammaticamente a causa di innovazioni rivoluzionarie nel campo dell'ottica e mouse transgenici. Diverse linee di Thy1-GFP topi transgenici, nei quali sottopopolazioni di neuroni sono geneticamente etichettati in distinti colori fluorescenti, consentono singoli neuroni di essere ripreso in vivo 1. Questi topi sono stati ampiamente utilizzati per imaging in vivo dei muscoli e del cervello 2-4 5-7, e hanno fornito indicazioni romanzo in meccanismi fisiologici che le analisi statiche non poteva essere risolto. Studi di imaging di neuroni nel midollo spinale di vita hanno cominciato solo di recente. Lichtman ei suoi colleghi hanno dimostrato la loro fattibilità per il monitoraggio feriti colonna dorsale (DC) assoni con grande campo microscopia 8,9. Multi-fotone in imaging in vivo di profondamente posizionati assoni DC, microglia e dei vasi sanguigni è stato anche compiuto 10. Nel corso degli ultimi anni, siamo stati i primi ad applicare imaging in vivo di monitorare la rigenerazione degli assoni DR utilizzando la microscopia a largo campo e la linea H del Thy1-YFP topi. Questi studi ci hanno portato ad una nuova ipotesi sul perché gli assoni DR viene impedito di rigenerazione nel midollo spinale 11.
In linea H del Thy1-YFP topi, distinto YFP assoni + sono posizionati superficialmente, che consente assoni diversi da monitorare contemporaneamente. Abbiamo imparato che gli assoni DR arrivare a DREZ sono meglio ripreso in lombare che nel midollo spinale cervicale. Nella presente relazione si descrivono diverse strategie che abbiamo trovato utile per assicurare il successo di imaging a lungo termine e ripetuti di rigenerare gli assoni DR. Tra questi metodi che eliminano l'intubazione ripetute e interruzione delle vie respiratorie, ridurre al minimo la chirurgia associata a stress e la formazione di cicatrici, e di acquisire immagini stabili ad alta risoluzione senza fototossicità.
Protocol
1. Microscopio impostare e preparazione di imaging
- Il nostro set è composto da immagini di uno stereomicroscopio Leica MZ16 fluorescente con un otturatore veloce e una camera CCD raffreddata controllato dal software Metamorph.
- Preparare una piastra elettrica termostato e regolare uscita a 32,5 ° C per mantenere la temperatura del corpo dell'animale durante e dopo l'intervento.
- Caldo Ringer sterile la soluzione o artificiale liquido cerebrospinale (ACSF) a 32,5 ° C in anticipo per l'irrigazione del midollo spinale durante l'intervento.
- Anestetizzare l'animale con un'iniezione intraperitoneale di xylazina (8 mg / kg) e ketamina (120 mg / kg) cocktail.
- Radere la parte superiore della schiena con tagliaunghie piccoli animali e diffondere una piccola goccia di lozione per capelli rimozione su tutta l'area rasata con tamponi di cotone con punta. Pochi minuti dopo, rimuovere la lozione applicata utilizzando il 70% spugne garza imbevuta di etanolo.
2. Laminectomia e l'esposizione chirurgica della radice L5 dorsale
- Posto l'animale in una riscaldata (32,5 ° C) pad e disinfettare la pelle con tamponi imbevuti etanolo al 70%.
- Sotto illuminazione in campo chiaro sul stereomicroscopio, eseguire un'incisione mediana (2 - a 3 cm) nella pelle della schiena. Se necessario, utilizzare tamponi di cotone con punta a fermare le emorragie.
- Riflettono la muscolatura della colonna vertebrale per esporre le vertebre lombari sottostante.
- Esporre la L3-S1 segmenti spinali da esterno destro di emi-laminectomia con Rongeurs di piccole dimensioni. Un laminectomia parziale esponendo 4-6 segmenti del midollo lombare e sacrale della colonna vertebrale è creato eliminando la parte destra dorsale delle vertebre L5 a livello della cresta iliaca dell'anca (posizione di DRG L5) rostralmente alle vertebre L2 (2 vertebre caudali alla costola). Perfusione della cavità con soluzione calda di Ringer sterile.
- Posizionare l'animale su un cuscino di supporto (garza di cotone arrotolato) per appiattire la colonna vertebrale. Utilizzare ganci di retrazione per ampliare l'area esposta.
- A questo punto (circa 30 minuti dopo la prima iniezione ip di anestetico, un supplemento (0.5X) deve essere iniettato per via sottocutanea al fine di mantenere l'animale completamente anestetizzato. In alternativa, l'anestesia gas (2-4% isoflurano in ossigeno 0.5L/min ) può essere usato per anestesia ripetuto durante le sessioni di imaging più di 1 ora.
3. Rizotomia / schiacciare radici dorsali
- Passa alla eccitazione di fluorescenza per visualizzare YFP etichettato (+) assoni.
- Utilizzando la punta di un Sub-Q (26ga.) ago, eseguire una piccola incisione della dura sovrastante la radice L5 dorsale (DR). Profumato ripetutamente con soluzione di Ringer e pulire delicatamente con la punta tamponi di cotone.
- Identificare il sito per essere schiacciato e inserire un lato di una pinza sottile (Dumont # 5) subdurally.
- Chiudere la pinza delicatamente ma con fermezza, tenendo la porzione mediale della radice L5 per 10 secondi, e poi delicatamente rilasciare il forcipe.
- Lavare ripetutamente con soluzione fisiologica e pulire delicatamente con la punta tamponi di cotone.
4. Acquisizione di immagini e post-op procedure
- Ottenere più immagini di tutta l'area esposta tra cui il sito e schiacciare il DREZ prima e subito dopo la calca sia a basso ingrandimento e alta.
- Le immagini sono acquisite sia come singolo o come istantanee più flussi da 10 a 20 fotogrammi acquisiti entro 30 - 40 ms tempo di esposizione. A fuoco le immagini vengono poi selezionati, e un montaggio panoramica viene creato successivamente con Photoshop.
- Per minimizzare la formazione della cicatrice, strettamente applicare un pezzo di sottile membrana matrice sintetica (Biobrane), seguita da artificiale dura, sulla parte superiore del midollo spinale esposti. Assicuratevi di tagliare pezzi per adattarsi precisamente nella finestra esposta midollo spinale in modo che siano aderenti al midollo spinale.
- Chiudere la muscolatura con 5-0 punti di sutura sterile e chiudere l'incisione sulla linea mediana con clip ferita.
- Iniettare la soluzione di Ringer (0,3 a 0,5 ml per via sottocutanea) e amministrare Buprenorfina come analgesia postoperatoria (0,05 mg / kg) per via sottocutanea ogni 12 ore per 2 giorni.
- Tenere l'animale in una piastra elettrica (34 ° -35 ° C) fino recuperato.
5. Immagini ripetute
- Anestetizzare l'animale e rimuovere le clip delle ferite e suture.
- Rimuovere artificiale dura e sottile membrana sintetica patch matrice e tenerli in un tubo sterile contenente soluzione di Ringer per un successivo riutilizzo.
- Rimuovere delicatamente ogni accumulato cicatrice tessuto connettivo con la punta piegata di un Sub-Q ago e pinza sottile. Profumato frequentemente con soluzione di Ringer calde.
- Ri-esporre il campo operatorio, compreso il sito schiacciare e DREZ, riposizionare YFP + assoni ripreso nelle sedute precedenti, e ripetere le procedure descritte nella sezione 4.
6. Rappresentante dei risultati:
Abbiamo osservato che, mentre essi non rigenerarsi dopo una lesione transezione, quasi tutti gli assoni + YFP cresciuto attraverso il sito dilesioni da 3 giorni dopo schiacciamento (Figura 1) 11. Tipicamente, il giorno dopo schiacciare, abbiamo osservato morire-back degenerazione degli assoni moncone prossimale e la frammentazione / degenerazione degli assoni stessi distale la calca, che ha confermato che gli assoni erano stati opportunamente danneggiati (ad esempio, figura 1, Giorno 3 e 5) . Diversi criteri aggiuntivi vengono applicati per distinguere in modo inequivocabile gli assoni rigeneranti da assoni che sono stati risparmiati o aveva recuperato dall'infortunio. Tra queste vi sono: (1) assoni rigeneranti mostrano un'espansione della non fluorescente porzione di YFP + assoni nel sito schiacciare a causa della degenerazione prossimale e distale (in contrasto con riduzione del divario senza etichetta a causa di citoplasma fluorescenti riempimento del sito schiacciare se assoni sopravvissuti alla lesione), (2) assoni rigeneranti sono molto più sottili, meno intensamente fluorescenti, e più ondulato di assoni sopravvissuti alla lesione; (3) neuriti rigenerante sono più sottili e più debolmente fluorescenti che i frammenti degenerando fluorescenti degli assoni attraverso il quale hanno esteso; (4) in contrasto con gli assoni sopravvissuti o risparmiata, gli assoni rigeneranti sosta al DREZ, e (5) al contrario di sopravvivere o assoni risparmiati, gli assoni rigeneranti non presentano i nodi di Ranvier. La figura 1 mostra quattro superficiale assoni YFP + subito dopo schiacciare (A1; frecce colorate). Tre giorni dopo la calca, tutti e quattro gli assoni estendere un singolo neurite che si sviluppa attraverso il sito schiacciare (A2). Cinque giorni dopo schiacciare, neuriti rimangono stabili e non c'è crescita supplementare da assoni questi o altri prossimale (A3).
I neuriti rigenerante che hanno attraversato il sito schiacciare allungata attraverso molto più spessa e più luminoso fluorescente frammenti di una degenerazione degli assoni (ovvero, tubi endoneurale), e arrivare al DREZ già 4 giorni dopo la calca (circa 3 mm / 2 giorni) 11. Immagine ripetuta di questi assoni e le loro punte ogni due o tre giorni per due settimane (Figura 2) ha rivelato che non sono cresciuti in avanti o ritrattare, ma è rimasto immobile. L'unico cambiamento è stato notevole gonfiore delle punte ed alberi di alcuni assoni. Queste osservazioni dimostrano quindi immobilizzazione incredibilmente veloce e croniche degli assoni rigeneranti al DREZ.
Figura 1: immagine ripetuta di L5 + DR YFP assoni nel sito di schiacciare spinali su 5 giorni. La porzione mediale della radice L5 è stato schiacciato (freccia rossa) e ripreso nei giorni 0, 3, e 5 dopo la calca. L'area della cotta è amplificato nei pannelli di destra (A1-A3).
Figura 2:. Immagini ripetute di assoni arrivati al DREZ oltre 20 giorni dopo schiacciare radice L5 4 ° giorno, tre assoni (frecce colorate) arrivato al DREZ. Le punte di questi assoni rimangono nella stessa posizione e hanno un aspetto simile a sessioni successive di imaging nei giorni 7, 9, 13, 15 e 20. Posizioni di una punta dell'assone rispetto alle punte degli assoni e altri punti di riferimento (asterischi) sono stati utilizzati per determinare la motilità degli assoni tra le sessioni di imaging.
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Discussion
Imaging DR rigenerazione direttamente in topi vivi è particolarmente impegnativa perché richiede una notevole laminectomia dorsale di monitorare la crescita degli assoni su una vasta area seguito da più interventi chirurgici invasivi e anestesia nelle sessioni successive di imaging. Diverse strategie aiutato a superare queste sfide. In primo luogo, l'imaging di successo richiede la riduzione della mortalità del mouse (circa il 25%), riducendo al minimo la durata dell'anestesia e sanguinamento, e da una meticolosa cura post-operatorio. La mortalità è stato ridotto utilizzando le impostazioni che consentono velocità veloce della telecamera di acquisire rapidamente le immagini multiple senza intubazione o interruzione delle vie respiratorie. Prevenire l'accumulo cicatrice sul cavo esposto è stato anche essenziale. Queste cicatrici collagene si sviluppano rapidamente tra le sessioni di imaging e formano uno strato sottile ma opaca sulla superficie dura. La rimozione è noioso, prolunga la sessione di immagine e rischi danni alla vascolarizzazione e assoni. Una strategia efficace per la rimozione della cicatrice è stato quello di applicare un sottile membrana matrice strettamente aderito al midollo esposti e causato ferite ad accumularsi sulla membrana piuttosto che sulla durata. A causa del rischio potenziale di effetti confondenti dovuti agli artefatti da procedure chirurgiche e photoxicity, abbiamo effettuato esperimenti di controllo esteso in cui abbiamo esaminato i profili assonale nei topi senza immagini ripetitive o interventi chirurgici.
I protocolli di utilizzare la microscopia widefield con impostazioni che consentono velocità veloce della fotocamera e acquisizione delle immagini, senza intubazione o interruzione delle vie respiratorie. Noi acquisire immagini multiple di assoni superficiale e poi selezionare le immagini migliori con la minima distorsione a causa di movimenti respiratori. Questo metodo fornisce insufficiente risoluzione spaziale, tuttavia, anche se consente una facile identificazione e tracciamento degli assoni superficialmente positioned DR su una vasta area: era impossibile avere la totalità degli assoni più concentrati in ogni sessione di imaging, o per ottenere immagini nitide di diverse suggerimenti degli assoni contemporaneamente e ripetutamente ogni volta.
Per facilitare l'identificazione degli assoni stessi in sessioni di immagini ripetute, si può considerare l'utilizzo di perline di microsfere fluorescenti (1μm, Invitrogen) per creare piu 'punti di riferimento', oltre a quelli intrinseci (ie, modelli unici ramificazione dei vasi sanguigni e assoni adiacenti) . Anche se le punte di crescita estremamente dinamici e cambiano forma in fretta, li si può identificare con loro albero degli assoni dei genitori, che rimane invariato perifericamente.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Alan Tessler per i commenti e aiuto editoriale. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH NS062320.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd, Inc. | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira Inc. | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional Products | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co. | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | BD Biosciences | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon Inc. | K-580 | |
| Wound clips | Perfect - Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments, Inc. | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices | ||
| Photoshop | Adobe |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
