Summary
En
Abstract
Den primära sensoriska axoner skadas av ryggmärgen rot skador misslyckas med att regenerera in i ryggmärgen, vilket leder till kronisk smärta och permanent känselbortfall. Förnyelse av dorsala (DR) axoner i ryggmärgen hindras på dorsala posten zon (DREZ), gränssnittet mellan CNS och PNS. Vår förståelse av de molekylära och cellulära händelser som hindrar förnyelse i DREZ är ofullständig, delvis på grund av komplexa förändringar i samband med nervskada har härledas från döden analyser. Dynamisk cellulära processer, såsom axonet förnyelse, är bäst studeras med metoder som fångar upp händelser i realtid med flera observationer av varje levande djur. Vår förmåga att övervaka nervceller serie in vivo har ökat dramatiskt på grund av revolutionerande innovationer inom optik och mus transgena. Flera rader av thy1-GFP transgena möss, där grupper av nervceller genetiskt märks i olika fluorescerande färger, tillåta enskilda nervceller som ska avbildas in vivo 1. Dessa möss har använts i stor utsträckning för in vivo avbildning av muskel 2-4 och hjärnan 5-7, och har gett nya insikter i fysiologiska mekanismer som statiska analyser inte kunnat lösas. Imaging studier av nervceller i levande ryggmärgen har först nyligen börjat. Lichtman och hans kollegor visade först deras genomförbarhet genom att spåra skadade dorsal kolumn (DC) axoner med brett fält mikroskopi 8,9. Multi-photon in vivo avbildning av djupt placerade DC axoner, har mikroglia och blodkärl också gjorts 10. Under de senaste åren har vi banat väg att tillämpa in vivo imaging att övervaka förnyelse av DR axoner med brett fält mikroskopi och H linje thy1-YFP möss. Dessa studier har lett oss till en roman hypotes om varför DR axoner hindras från att återskapa i ryggmärgen 11.
I H linje thy1-YFP möss, är separata YFP + axoner ytligt placerade, vilket gör att flera axoner som skall övervakas samtidigt. Vi har lärt oss att DR axoner anländer till DREZ bättre avbildas i ländryggen än i cervikala ryggmärgen. I föreliggande rapport beskriver vi flera strategier som vi har funnit användbara för att säkra framgångsrika långsiktiga och upprepade avbildning av regenererande DR axoner. Dessa inkluderar metoder som eliminerar upprepade intubation och respiratoriska avbrott, minimera kirurgi-associerade stress och ärrbildning, och förvärva stabila bilder med hög upplösning utan fototoxicitet.
Protocol
1. Mikroskop ställa in och bildhantering förberedelse
- Vår avbildning inrättat består av en Leica MZ16 fluorescerande stereomikroskop med en snabb slutare och en kyld CCD-kamera som styrs av metamorfa programvara.
- Förbered en termostatreglerad värmedyna och anpassa produktionen till 32,5 ° C för att upprätthålla djurets kroppstemperatur under och efter operation.
- Varm steril Ringers lösning eller konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) till 32,5 ° C i förväg för bevattning av ryggmärgen under operation.
- Bedöva djur med en intraperitoneal injektion av xylazin (8 mg / kg) och ketamin (120 mg / kg) cocktail.
- Raka övre delen av ryggen med små djur Clippers och sprida en liten droppe hårborttagning lotion över det rakade området med bomullspinne kompresser. Minuter senare, ta bort den använda lotion med 70% etanol indränkt kompress svampar.
2. Laminektomi och kirurgisk exponering av L5 dorsalrotsganglier
- Placera djuret på en uppvärmd (32,5 ° C) pad och desinficera huden med 70% etanol dränkta kompresser.
- Under ljusa fält belysning på stereomikroskop, utför en mittlinjen snitt (2 - till 3-cm) i huden på ryggen. Använd vid behov bomullspinne kompresser för att stoppa blödning.
- Spegla spinal muskulaturen att exponera den underliggande ländkotorna.
- Exponera L3-S1 spinala segment genom högersidig hemi-laminektomi med små rongeurs. En partiell laminektomi exponera 4-6 segment av den lumbala och sakrala ryggmärgen skapas genom att ta bort rätten dorsala delen av L5 kotorna i nivå med höftbenskammen i höft (placering L5 DRG) rostrally till L2 kotorna (2 kotor caudal till sista revbenet). BEGJUTA kaviteten med varmt steril Ringers lösning.
- Placera djuret på ett stöd kudde (rullade gasväv) för att platta till ryggraden. Använd dementi krokar för att bredda det utsatta området.
- Vid denna punkt (ca 30 minuter efter den första ip injektion av bedövningsmedel, bör ett tillägg (0,5 x) ges som subkutan injektion för att hålla djuret helt sövd. Alternativt, gas anestesi (2-4% isofluran hos 0.5L/min syre ) kan användas för upprepad anesthetization under avbildning sessioner längre än 1 timme.
3. Rhizotomy / dorsalrotsganglier krossa
- Växla till fluorescens excitation att visualisera YFP märkt (+) axoner.
- Hjälp av spetsen på en Sub-Q (26ga.) nål, gör ett litet snitt i dura överliggande den L5 dorsala (DR). BEGJUTA upprepade gånger med Ringers lösning och rengör försiktigt med bomullspinne kompresser.
- Identifiera platsen för att krossas och sätta ena sidan av en fin peang (Dumont # 5) subdurally.
- Stäng pincett försiktigt men bestämt, att hålla den mediala delen av L5 roten i 10 sekunder, och sedan försiktigt släppa pincett.
- Tvätta flera gånger med fysiologisk lösning och rengör försiktigt med bomullspinne kompresser.
4. Bild förvärv och postoperativa rutiner
- Skaffa flera bilder av den exponerade hela området inklusive krossa webbplatsen och DREZ före och direkt efter krossa på både låg och hög förstoring.
- Bilderna förvärvas antingen som enskilda bilder eller flera strömmar på 10 till 20 bildrutor förvärvats inom 30 - till 40-ms exponeringstid. I fokus bilderna sedan blir utvald, och en översikt montage skapas senare med hjälp av Photoshop.
- För att minimera ärrbildning, tätt tillämpa en bit tunn syntetiska matrix membran (Biobrane), följt av artificiella dura, på toppen av den exponerade ryggmärgen. Var noga med att klippa bitar för att passa just i den exponerade ryggmärgen fönster så att de är anhängare till ryggmärgen.
- Stäng muskulaturen med steril 5-0 suturer och nära mittlinjen snitt med sår klipp.
- Injicera Ringers lösning (0,3 till 0,5-ml subkutant) och administrera buprenorfin som postoperativ analgesi (0,05 mg / kg) subkutant var 12 h för 2 dagar.
- Håll djur på en värmedyna (34 ° -35 ° C) fram återvinnas.
5. Upprepade imaging
- Bedöva djuret och ta bort såret klipp och suturer.
- Ta bort konstgjorda dura och tunna syntetiska matrix fläckar membranet och hålla dem i ett sterilt rör som innehåller Ringers lösning för senare återanvändning.
- Ta försiktigt bort eventuella ackumulerade ärr bindväv med böjda spetsen på en Sub-Q nål och fin pincett. BEGJUTA ofta med varm Ringers lösning.
- Re-exponera operativa området, inklusive krossa platsen och DREZ, flytta YFP + axoner avbildas i tidigare sessioner, och upprepa de förfaranden som beskrivs i avsnitt 4.
6. Representativa resultat:
Vi har konstaterat att medan de inte regenerera efter en transection skada, växte nästan alla YFP + axoner till platsen förskada genom 3 dagar efter att krossa (Figur 1) 11. Typiskt, nästa dag efter krossa, konstaterade vi döende tillbaka degeneration av proximala stumpen axoner och fragmentering / degeneration av samma axoner distalt om krossa, som bekräftade att axoner lämpligt hade skadats (t.ex. figur 1, dag 3 och 5) . Flera ytterligare kriterier tillämpas för att entydigt skilja regenererande axonerna från axoner som skonades eller hade återhämtat sig från skadan. Bland annat följande: (1) regenererande axonerna visar en expansion av den icke-fluorescerande delen av YFP + axonet på krossa plats beroende på proximala och distala degeneration (i motsats till förträngning av omärkta gapet på grund av fluorescerande cytoplasman påfyllning av krossa webbplatsen Om axoner överlevde skada), (2) regenererande axoner är mycket tunnare, mindre starkt fluorescerande och mer kuperad än axoner som överlevde skadan, (3) regenererande neurites är tunnare och mer svagt fluorescerande än den degenererade fluorescerande fragment av axoner genom vilka de sträckte sig, (4) i motsats till efterlevande eller skonade axoner, regenererande axonerna stanna vid DREZ, och (5) i motsats till efterlevande eller skonade axoner, inte regenererande axonerna inte uppvisar noder Ranvier. Figur 1 visar fyra ytliga axoner YFP + direkt efter att krossa (A1; färgade pilar). Tre dagar efter krossa, alla fyra axoner förlänga en enda neurite som växer genom trängseln plats (A2). Fem dagar efter att krossa, neurites vara stabil och det finns ingen ytterligare tillväxt från dessa eller andra proximala axoner (A3).
Den regenererande neurites som korsade krossa webbplatsen långsträckt igenom mycket tjockare och ljusare fluorescerande fragment av en degenererande axonet (dvs endoneurial rör), och anländer till DREZ så tidigt som 4 dagar efter krossa (ca 3 mm / 2 dagar) 11. Upprepade avbildning av dessa axoner och tips varje två eller tre dagar för ytterligare två veckor (figur 2) visade att de inte växer fram eller tillbaka, men förblev orörlig. Den enda märkbara förändringen var svullnad av tips och axlar av vissa axoner. Dessa observationer visar därför förvånansvärt snabbt och kronisk fixering av regenererande axoner på DREZ.
Figur 1: Upprepad avbildning av L5 DR YFP + axoner på platsen för dorsala krossa under 5 dagar. Den mediala delen av L5 roten krossades (röd pil) och avbildat dag 0, 3 och 5 efter krossa. Det område av krossa är förstorat i den högra panelerna (A1-A3).
Figur 2:. Upprepad avbildning av axoner anlände till DREZ under 20 dagar efter L5 roten krossa Dag 4, tre axoner (färgade pilar) anlände till DREZ. De tips av dessa axoner kvar på samma plats och har ett liknande utseende i kommande avbildning sessioner på dag 7, 9, 13, 15 och 20. Placering av ett axon spets i förhållande till andra axon tips och landmärken (asterisker) användes för att bestämma Axon motilitet mellan avbildning sessioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Imaging DR förnyelse direkt i levande möss är särskilt utmanande eftersom det kräver en avsevärd rygg laminektomi att övervaka axon tillväxt över ett stort område följt av flera invasiva kirurgiska och anestesi i efterföljande bildbehandling sessioner. Flera strategier hjälpte till att övervinna dessa utmaningar. Först lyckade avbildning krävs att minska musen dödlighet (cirka 25%) genom att minimera den tid som anestesi och blödning, och genom noggrann post-op vård. Dödligheten minskade också med hjälp av inställningar som tillåter snabb kamera hastighet för att snabbt skaffa flera bilder utan intubation eller respiratorisk avbrott. Förhindra ärr som samlas på utsatta sladden var också viktigt. Dessa kollagen ärr utvecklas snabbt mellan avbildning sessioner och bildar ett tunt men täckande lager på dura ytan. Borttagning är jobbigt, förlänger bilden sessionen och risker skador på kärl och axoner. En effektiv strategi för ärr avlägsnande var att tillämpa en tunn matris membran som tätt följt de utsatta sladden och orsakade ärr samlas på membranet snarare än på dura. På grund av risken för störande effekter på grund av artefakter från kirurgiska ingrepp och photoxicity genomförde vi omfattande kontroll experiment där vi undersökte axonal profiler i möss utan regelbundet återkommande avbildning eller kirurgi.
De protokoll som använder widefield mikroskopi med inställningar som tillåter snabb kamera hastighet och bild förvärv, utan intubation eller respiratorisk avbrott. Vi förvärvar flera bilder av ytliga axoner och senare välja de bästa bilderna med minsta möjliga snedvridning på grund av andningsrörelser. Denna metod ger tillräcklig rumslig upplösning, dock, även om det möjliggör enkel identifiering och spårning av ytligt placerade DR axoner över ett stort område: det var omöjligt att ha helheten av flera axoner fokuserade i varje avbildning session, eller att få tydliga bilder av flera axon tips samtidigt och flera gånger varje gång.
För att underlätta identifieringen av samma axoner i upprepade avbildning sessioner kan man överväga att använda fluorescerande mikrosfär pärlor (1μm, Invitrogen) för att skapa mer "landmärken", förutom de inneboende dem (dvs. unika förgrening mönster av blodkärl och angränsande axoner) . Även om tillväxten tips är mycket dynamisk och ändrar form snabbt, kan man identifiera dem genom deras föräldrar Axon axel, som förblir oförändrad perifert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Alan Tessler för kommentarer och redaktionellt hjälp. Detta arbete stöddes av NIH NS062320.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd, Inc. | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira Inc. | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional Products | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co. | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | BD Biosciences | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon Inc. | K-580 | |
| Wound clips | Perfect - Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments, Inc. | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices | ||
| Photoshop | Adobe |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
