Summary
Dieser Artikel beschreibt Oberfläche Kennzeichnung und
Abstract
Embryonale Epithelien unterziehen komplexe Verformungen (z. B. Biegen, Drehen, Falten und Dehnung) auf die primitive Organe des frühen Embryos bilden. Tracking fiducial Markierungen auf der Oberfläche dieser Hohlkammerplatten ist eine gut etablierte Methode zur Schätzung der morphogenetischen Größen wie Wachstum, Schrumpfung und Scherung. Allerdings sind nicht alle Oberflächen Kennzeichnung Techniken ohne weiteres mit herkömmlichen bildgebenden Verfahren und besitzen unterschiedliche Vor-und Nachteile. Hier beschreiben wir zwei Kennzeichnung Methoden und illustrieren den Nutzen der einzelnen Verfahren. Bei der ersten Methode werden hunderte von fluoreszierenden Markierungen gleichzeitig auf den Embryo mit magnetischen Eisenteilchen angewendet. Diese Etiketten werden dann an Menge 2-D Gewebe Deformationen während der Morphogenese verwendet. In der zweiten Methode werden Polystyrol-Mikrosphären als Kontrastmittel in der nicht-invasiven optischen Kohärenztomographie (OCT) Bildgebung verwendet werden, um 3-D Gewebe Deformationen zu verfolgen. Diese Techniken wurden erfolgreichly in unserem Labor zu physikalischen Mechanismen der frühen Kopffalte, Herz und die Entwicklung des Gehirns studythe umgesetzt und sollte anpassungsfähig sein, um eine breite Palette morphogenetischen Prozessen.
Protocol
1. Allgemeine Experimentelle Vorbereitung
- Bereiten Gewebekulturmedium in der Laminar-Flow-Haube.
- Verdünnen Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (1 L Flasche mit 4,5 g / L Glucose, Natriumbicarbonat und L-Glutamin). Fügen Sie 10 ml Penicillin / Streptomycin / Neomycin Antibiotika.
- Nehmen Sie 100 ml DMEM mit einem sterilen Transferpipette und ersetzen mit 100 ml chick Serum.
- Aliquot der DMEM/10% chick Serum / 1% Antibiotika in sterile 15 ml konischen Röhrchen und frieren.
- Bereiten Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit Kalzium und Magnesium ergänzt. Mix 100 ml 10x PBS, 900 mL deionisiertes Wasser und 1 mL einer konzentrierten Calcium-und Magnesium-Lösung (100 mg / mL CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/ml MgCl 2 • 6H 2 O).
- Inkubieren Eier in einer Längsausrichtung auf die gewünschte Stufe durch Hamburger und Hamilton 1 (dh 23-25 Stunden für HH Stufe 5 oder 42 definiert-48 Stunden für HH Stufen 11-12).
- Entfernen Embryonen aus dem Ei mit dem Filterpapier Träger-Methode.
- Crack the bottom des Eies an der Seite des A150 mm Petrischale. Auseinanderziehen der Schale von unten und entleeren Sie den Inhalt des Eies in die Schüssel.
- Entfernen Sie die dickere, zähflüssige Eiweiß aus dem Ei mit einer stumpfen Zange.
- Cut Kreisen Whatman Nr. 2 Filterpapier 2-3 cm. im Durchmesser. Mit einem einzigen Locher, Löcher in der Mitte des Filterpapiers. Legen Sie eine der Filterpapier Ringe auf das Eigelb in einer Weise, dass der Embryo sichtbar durch das zentrale Loch in den Ring hält.
- Cut um den Außendurchmesser des Filterpapier mit Mikroschere. Entfernen Sie das Papier aus dem Eigelb mit feinen Pinzetten.
- Vorsichtig abspülen den Embryo in PBS, um anhaftende Dotter Partikel zu entfernen. (HH5 Embryonen müssen so lange wie 15-20 Minuten einweichen, um restliche Eigelb zu entfernen). Entfernen Sie das Filterpapier Montage aus dem Bad und legen Sie es Bauchseite in einem35 mm Kulturschale. Platzieren Sie ein zweites Filterpapier Ring auf dem ersten, sandwiching der Embryo zwischen den Ringen. Setzen Sie einen Metallring um die Außenseite des Filterpapiers Sandwich (≈ 1,5 bis 2 cm Durchmesser), um den Embryo zu sichern.
- Tauchen Sie den Embryo in Kulturmedium. Überprüfen Sie richtige Morphologie und embryonalen Stadium mit einer Hellfeld-Mikroskop.
- Mit einer Pipette puller zu feinen Spitze Glasnadeln (1,5 mm Innendurchmesser) (World Precision Instruments, Sarasota FL) für nachfolgende Gewebe Dissektionen und Kennzeichnung vorzubereiten.
2. DiI Markierung von HH Stage 5 Embryonen mit Magnetic Eisenpartikel
- Fügen Sie einige Tropfen der gesättigten DiI in Alkohol, um eine geringe Menge an Eisenpulver (Eisen reduziert, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) bei Raumtemperatur und trocknen lassen. (Diese Regel bewirkt, dass die Partikel an Kuchen zusammen, sobald der Alkohol verdunstet ist.) Verwenden Sie die Spitze eines gezogen Mikropipette zum Aufbrechen der verklumpten Eisenpartikel,Übertragen auf ein Mikrozentrifugenröhrchen, und spülen Sie sie mehrmals und decken mit VE-Wasser.
- Um label Ektodermzellen in einem HH Stufe 5 Embryo, legen Sie die geernteten Embryo (dh die gesamte Filterpapier Montage) Dorsalseite in einer 35 mm Kulturschale mit einer großzügigen Schicht von Kulturmedien abgedeckt und die Schüssel unter einem Binokular. Verwenden Sie ein Glas Nadel die Dotterhaut zu entfernen und setzen die Ektodermzellen. (Achten Sie darauf, nicht gewaltsam öffnen Embryo.)
- Zeichnen Sie eine Spalte markiert Eisenpartikel (in VE-Wasser) in eine Pasteurpipette. Mit dem Binokular, tauchen die Pipettenspitze unter der Flüssigkeitsoberfläche und Position genau über dem Embryo. Rollende die Pipette langsam hin und her zwischen den Fingerspitzen, drängeln sich die Partikel aus dem pipiette und streuen sie über den Embryo.
- Sobald der Embryo mit Partikeln bedeckt, vorsichtig legen Sie sie in einem 37 ° C Inkubator für etwa 10 Minuten. Nehmen Embryo aus dem Inkubator eind mit einem starken Magneten, um die Partikel zu entfernen.
- Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop mit angeschlossener Videokamera und entsprechende Filter-Einstellungen sowohl Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder des Embryos zu erwerben, wie in Abbildung 2a, b dargestellt
- Beachten Sie das Etikett Dichte. Wenn eine dichtere Verteilung gewünscht ist, verwenden Sie zusätzliche Teilchen (wie oben beschrieben), um den Embryo wieder Etikett und verlängern die Inkubationszeit entsprechend. Wenn die Etiketten zu dicht sind, fügen Sie eine kleine Menge an unmarkiertem Eisenpartikel auf die Mikrozentrifugenröhrchen mit bereits markierten Partikeln gefüllt und Mix der Inhalt des Röhrchens. Wiederholen Sie die Kennzeichnung mit einem neuen Embryo und wieder beachten label Dichte.
3. Polystyrol Microsphere Labeling für Optical Coherence Tomography (OCT) Imaging von HH11-12 Embryonen
- Bereiten Sie eine Lösung aus schwarz 10 Mikrometer Durchmesser Mikrosphären (Polysciences Inc., Warrington, PA) in PBS in einer 35 mm Petrischale. (Beads sollte groß genug sein, um den Kontrast für die OCT erzeugtBildgebung, aber klein genug, so dass Korngröße in der Größenordnung von einzelnen Zellen ist. Spezifische Werte werden in Abhängigkeit von der Auflösung Ihres OCT-System variieren und das Gewebe untersucht). Ein Tropfen der Stammlösung (2,6% Feststoffe-Latex) pro ml PBS ist in der Regel ausreichend. Ziehen Sie diese Lösung in eine 10cc Spritze mit einer 22-Gauge-Nadel. Vortex die Lösung für 30 Sekunden, um eine gleichmäßige Raupe Verteilung zu gewährleisten.
- Bevel die Spitzen deiner gezogen Glasnadeln mit einer Computer-Festplatte 2. Tipp Durchmesser sollte groß genug sein, dass Perlen können durch die Öffnung passen, aber zur gleichen Zeit, so klein wie möglich, um Gewebe verletzt während der Injektion zu minimieren.
- Füllen Sie eine abgeschrägte Glas Nadel mit dem Bead-Lösung mit der Spritze. Leicht flick der Mikropipette, um sicherzustellen, dass die Lösung die Spitze erreicht.
- Mit einem Mikromanipulator, statt das Glas Nadel im selben Sichtfeld wie der Embryo. Perlen sollten fließt aus der Pipettenspitze.
- Wenn keine beads Ausfahrt der Mikropipette kann es zu einer Verstopfung sein. In diesem Fall wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4 mit einem neuen Glas-Nadel.
- Wenn zu viele Perlen Ihr Blickfeld Wolke, kann Ihr Pipettenspitze zu breit sein. Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,4 mit einer neuen Pipette und eine neue Embryo.
- Legen Sie die Pipettenspitze in das Lumen des Gehirns Röhre. Achten Sie darauf, nicht zu durchbohren der ventralen Boden des Gewebes. Sie sehen eine vorübergehende Schwellung des Gewebes, wie Perlen und Flüssigkeit geben das Lumen. Dies deutet auf eine erfolgreiche Intubation, jetzt schnell zu entfernen, das Glas Nadel.
- Überprüfen Sie, ob eine ausreichende Dichte Wulst in das innere Lumen des Gehirns Rohr mit einer Hellfeld-Mikroskop. Lassen Sie die Perlen für 20 absetzen - 30 Minuten, bevor Sie fortfahren zu Sect. 4.
4. Data Acquisition
* Die folgenden Methoden sind auch für die Fluoreszenz-Markierung oben beschriebene Technik geeignet. Doch mit der Mikrosphären-Kennzeichnung Technik können Wülste lösen bei der Übertragung von Probenzwischen Gründerzentren und Imaging-Systemen. In diesem Fall ist es am besten vorgehen, um 4,2 (das vermeidet Probe Bewegung / Agitation insgesamt) Schritt. Bei beiden Verfahren werden Embryonen gezüchtet, während in flüssigem Kulturmedium eingetaucht. Wenn der Embryo nicht vollständig unter Wasser (wie es der Fall mit einigen konventionellen Zellkultur-Techniken), Gewebe-Geometrie ist stark durch abnorm hohen Oberflächenspannung Lasten und Belastungen Distributionen verändert wird scheitern genau zu erfassen normalen 3-D Morphogenese 3, 4. Darüber hinaus Eintauchen des Gewebes verhindert, dass die hellen Kontrast an der Flüssig-Gas-Grenzfläche während OCT-Bildgebung beobachtet von Verschleierung embryonalen Morphologie und Marker-Koordinaten.
- Embryo Culture (allgemein)
- Nach dem Erwerb Ihres ersten Bilder (Hellfeld-, Fluoreszenz-oder OCT), legen bis zu sieben 35 mm Kulturschalen (mit Embryonen) in einem 150 mm Petrischale und legen Sie die gesamte Baugruppe in eine kleine Plastiktüte. Fügen Sie ein paar Tropfen deionisiertes Wasser in den Beutel für die Befeuchtungund füllen Sie den Beutel mit einem 95% O 2 / 5% CO 2-Gemisch. Legen Sie die Embryonen in den Brutschrank bei 37 ° C (Queue Stabiletherm, Asheville, NC) für die gewünschte Zeit bis zum nächsten Bildgebung Zeitpunkt. Mit dieser Methode können Experimente an mehreren Embryonen in den selben Tag durchgeführt werden.
- Zeitraffer-Kultur (automatisiert)
- Zeigen Sie mit der Bezeichnung Embryonen in ein Delta T Dish (35 mm Außendurchmesser, 23 mm zentrale Öffnung mit kegeliger Seitenwand, 0,17 mm dickes Glas; Bioptechs, Butler, PA) mit 1,2 ml Kulturmedium.
- Decken Sie die Schüssel mit einem Glasdeckel bei 37 ° C mit einem Bioptechs Delta T4 Kulturschale Controller (zur Vermeidung von Kondensation). Superfuse der Embryo mit 95% O 2 / 5% CO 2-Gas-Gemisch aus einem Mini-Pump Variable-Flow-Gerät (Fisher Scientific) geliefert. Vor Erreichen des Embryos, Wärme und Befeuchten des Gases durch das Sprudeln es durch VE-Wasser an einem warmen (<100 ° C) heißen Platte. Eine schematische Darstellung dieser experimentellen set-up ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Richten Sie die Software automatisch erwerben Bilder mit vom Benutzer festgelegten Zeitintervallen. Für unsere Fluoreszenzmikroskop, verwenden wir Openlab Software (PerkinElmer, Waltham, MA), und für unsere OCT-System verwenden wir gefegt Quelle Thorlabs Software (Newton, NJ). Da diese Methode wird derzeit nur in der Lage Handhabung eines Zeitraffer-Experiment am einer Zeit, ist es oft am besten, damit diese Art von Kulturen über Nacht laufen. Man könnte diese Einschränkung durch die Installation eines automatisierten übersetzbar Bühne kompatibel sowohl mit der Hard-und Software der Imaging-System 5 zu umgehen.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Die Etiketten werden automatisch (mit Volocity, PerkinElmer) verfolgt oder manuell (mit Hilfe des Handbuchs Tracking-Plugin in ImageJ, NIH) in jedem Experiment. In der Fluoreszenzmarkierung Technik verwenden wir die Matlab-Routine Gridfit 2D-Flächen durch die Marker-Koordinaten, die ermöglicht fit morphogenetic Oberfläche Stämme 6, 7 berechnet werden. Standard-Gleichungen werden verwendet, um diese Werte in eine entsprechende embryonalen Koordinatensystem zu transformieren. Alternativ kann in der OCT-Technik, Oberflächen sind aus segmentierten Bild Bände (erhalten über Standard-Software wie Matlab oder Caret 8) und Stämme generiert in Richtung der maximalen oder minimalen Krümmung der Probe 9 berechnet werden.
Wir nutzten unsere Eisenpartikelgehalt Technik zur Kennzeichnung und Verfolgung der Bewegung der ektodermalen Zellen während der Kopf Faltenbildung in den frühen Hühnerembryo. Wie in Abbildung 2a dargestellt wurden fluoreszenzmarkierte Zellen über den gesamten Embryo verteilt. Hellfeld-und Fluoreszenz-Bilder des Embryos wurden in unterschiedlichen Abständen während ex ovo Kultur eingefangen. Die Bewegungen der verfolgten Etiketten (Abb. 2B, C) wurden dann verwendet, um die sich entwickelnde morphogenetische Dehnungsverteilungen während Kopf Faltenbildung (Abb. 2D-F) zu berechnen.
t "> Ähnlich unserer Polystyrol-Mikrokügelchen-Technik verwendet wurde, um Gewebe Bewegungen in der Mitte Hinterhirn-Grenze des frühen chick Gehirn zu verfolgen. Wie in Abbildung 3 BD gezeigt, wurden bead Bewegungen für 6 Stunden und Stämme verfolgt Charakterisierung Gewebe Verformung in Längs-und Umfangsrichtung wurden von Marker-Koordinaten berechnet. Beachten Sie, dass diese Methode geeignet für eine deutlich 3-D Verformungen ist wie Perlen auf allen Seiten des inneren Lumen des Gehirns (Abb. 3A) Verkleben neigen.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Set-up für Zeitraffer-Gewebekultur.
Abbildung 2. Quantifizierung 2-D Gewebe Deformationen in den frühen Hühnerembryo mit verfolgt Fluoreszenzmarker. (A) Merged Hellfeld / Fluoreszenzbild von HH Stufe 5 Embryo nach Entfernung der Eisenpartikel. DiI-Labeled ektodermalen Zellen (rot) sind über den gesamten Embryo verteilt. (B, C) Die Bewegung der markierten Zellen wurde anhand ImageJ. Label Verschiebungen wurden in Embryo-Koordinaten (X, Y) berechnet. Beachten Sie, dass A und B das gleiche Bild sind. (DF) Konturdiagramme der sich entwickelnden Längsdehnung Ausschüttungen während der Kopf Faltenbildung. Longitudinal Lagrange-Stämme wurden in Bezug auf Stufe 5 HH (dh A und B) nach (D) 75 min, (E) 120 min, und (F) 165 min Inkubation berechnet. Diese Stämme zeichnen die Längenänderungen der Linienelemente ursprünglich orientiert entlang der Y-Achse (in der Stufe 5 Embryo). Weitere Einzelheiten zur Verwendung verfolgt label Koordinaten morphogenetic Stämme berechnen kann in Filas et al. (2007) 6 und Varner et al. (2010) 7 gefunden werden. Beachten Sie, dass C-und F das gleiche Bild sind. Maßstab = 500 pm.
Abbildung 3. Quantifizierung 3-D Gewebe deformations in den frühen chick Gehirn. (A) Polystyrol-Mikrokügelchen, die die dorsale (schwarzer Pfeil) haften und ventralen (weißer Pfeil) Seiten des Gehirns Röhre sind leicht erkennbar vom umgebenden Gewebe in Quer section.Ventral Ansichten der OCT-Rekonstruktionen zeigen Mikrosphäre Orten in der Nähe der Mitte des Hinterhirn-Grenze bei (B) HH12 und nach (C) 6 h Inkubation (M: Mittelhirn, H: Rautenhirn). Mehrere Gruppen von Perlen sind umrissen, um die gesamte Verformung des Gewebes zu markieren. (D) Longitudinal (E zz) und radiale (E θθ) Lagrange-Stämme wurden aus diesen Verformungen berechnet. Positive und negative Längs-Umfangs-Stämme in der Mitte Hinterhirn-Grenze spiegeln eine axiale Verlängerung und Verkürzung der umlaufenden dieser Region während der Kultur. Weitere Einzelheiten zur Berechnung der morphogenetischen Stämme für komplexe Oberflächen während der Morphogenese in Filas et al. (2008) 9 gefunden werden. Maßstab = 200 um.
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Discussion
Zwei Gewebe Kennzeichnung Techniken sind für die ex ovo Kultur der frühen Hühnerembryonen vorgestellt. Die erste nutzt fluoreszierende lipophile Farbstoffe über magnetische Eisenteilchen ausgeliefert, gleichzeitig label Hunderte von Zellen. Allerdings ist diese Methode derzeit nicht kompatibel mit optischen Kohärenztomographie, als Fluoreszenzfarbstoffe in der Regel wenig Kontrast aus den umliegenden Geweben unter Verwendung von 10 Oktober zeigen. Daher zeigen wir eine alternative Technik unter Verwendung von Polystyrol-Mikrosphären zu Geweben für Zeitraffer-Oktober-Analyse-Label. Diese Technik liefert 3-D-Datensätze, aber darauf zu achten, nicht zu den Perlen aus dem Gewebe entfernen werden. Mit einer dieser Methoden in die entsprechenden experimentellen Setting sollten zuverlässige Gewebe Kennzeichnung und ex ovo Entwicklung in frühen Embryonen. Beide Methoden verwenden leicht verfügbar, relativ kostengünstige Materialien (z. B. Eisenpulver, Polystyrol-Mikrosphären) und ermöglichen Gewebe Verformung während der Morphogenese quantifiziert werden. DieGewebemerkmale in beiden Fällen lässt sich einfach und reproduzierbar aufgetragen zu embryonalem Gewebe und erfordern keine spezielle Ausrüstung, so dass diese Experimente zugänglich für Neulinge auf diesem Gebiet. Visualisierung und Analyse der gewonnenen Daten (z. B. durch Computer-morphogenetic Belastung Karten) sollte helfen, beleuchten die Mechanik der Morphogenese in Ihrem Modell-System 6, 7, 9, 11, 12.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt R01 GM075200 und R01 HL083393 (LAT) unterstützt. Wir erkennen Gemeinschaft Unterstützung für BAF von NIH T90 DA022871 und die Mallinckrodt Institute of Radiology, und VDV aus gewähren 09PRE2060795 von der American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM — high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments, Inc. | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences, Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
References
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