Summary
Questo articolo descrive l'etichettatura di superficie e
Abstract
Embrionale epiteli subiscono deformazioni complesse (ad es flessione, torsione, piegatura, e stretching) per formare gli organi primitiva dell'embrione precoce. Monitoraggio marcatori fiduciali sulla superficie di questi fogli cellulare è una consolidata metodo per stimare quantità morfogenetici, come la crescita, la contrazione e taglio. Tuttavia, non tutte le tecniche di etichettatura di superficie sono facilmente adattabili alle modalità di imaging convenzionali e in possesso di diversi vantaggi e limitazioni. Qui, descriviamo due metodi di etichettatura e illustrare l'utilità di ogni tecnica. Nel primo metodo, centinaia di etichette fluorescenti sono applicate simultaneamente per l'embrione utilizzando particelle di ferro magnetico. Queste etichette vengono poi utilizzati per quantità 2-D deformazioni durante la morfogenesi dei tessuti. Nel secondo metodo, microsfere di polistirolo sono utilizzati come agenti di contrasto a non invasiva tomografia a coerenza ottica (OCT) per tenere traccia di imaging 3-D deformazioni del tessuto. Queste tecniche hanno avuto successoLy implementato nel nostro laboratorio per studioIl meccanismi fisici di piegare la testa all'inizio, il cuore, e lo sviluppo del cervello, e dovrebbe essere adattabile ad una vasta processi morfogenetici gamma.
Protocol
1. Preparazione generale Sperimentale
- Preparare terreno di coltura dei tessuti in cappa a flusso laminare.
- Diluire Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) (1 bottiglia di L con 4,5 g / L glucosio, bicarbonato di sodio, e L-glutamina). Aggiungere 10 ml di penicillina / streptomicina / neomicina antibiotici.
- Togliere 100 ml di DMEM con una pipetta sterile per il trasferimento e sostituire con 100 ml di siero pulcino.
- Aliquota del pulcino DMEM/10% di siero / 1% di antibiotici sterili in 15 flaconcini ml e congelare.
- Preparare tampone fosfato (PBS) integrato con calcio e magnesio. Mescolare 100 ml PBS 10X, 900 ml di acqua deionizzata, e 1 ml di una soluzione concentrata di calcio e di magnesio (100 mg / mL di CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/ml MgCl 2 • 6H 2 O).
- Incubare le uova con un orientamento longitudinale in scena desiderata come definito da Hamburger e Hamilton 1 (cioè 23-25 ore per HH fase 5, o 42-48 Ore per le fasi HH 11-12).
- Rimuovere gli embrioni dall'uovo utilizzando il filtro metodo vettore carta.
- Crepa sul fondo dell'uovo sul lato del piatto A150 millimetri di Petri. Separare il guscio dal basso e svuotare il contenuto delle uova nel piatto.
- Rimuovere la spessa, albume viscoso dall'uovo con pinze contundente.
- Tagliare cerchi di Whatman # 2 carta da filtro 2-3 cm. di diametro. Utilizzando un unico fori, buchi pugno nel bel mezzo della carta da filtro. Luogo uno degli anelli carta da filtro sul tuorlo in un modo che mantiene l'embrione visibile attraverso il foro centrale sul ring.
- Taglio intorno al diametro esterno della carta da filtro con microscissors. Rimuovere la carta dal tuorlo con una pinza sottile.
- Lavare delicatamente l'embrione in PBS per rimuovere le particelle tuorlo aderente. (HH5 embrioni potrebbe essere necessario in ammollo fino a 15-20 minuti per rimuovere residui di tuorlo). Rimuovere il gruppo del filtro di carta dal bagno e posizionarla lato ventrale in un35 millimetri piatto cultura. Posizionare un secondo anello filtro di carta in cima al primo, l'embrione sandwich tra gli anelli. Mettere un anello di metallo intorno alla parte esterna del sandwich carta da filtro (≈ 1,5-2 cm di diametro) per fissare l'embrione.
- Immergere l'embrione nel terreno di coltura. Verifica corretta morfologia e allo stato embrionale con un microscopio in campo chiaro.
- Utilizzare un estrattore pipetta per preparare bene gli aghi di vetro punta (1,5 mm di diametro interno) (Strumenti di precisione mondiale, Sarasota FL) per dissezioni dei tessuti successive ed etichettatura.
2. Dii Etichettatura di HH Fase 5 embrioni utilizzando particelle di ferro magnetico
- Aggiungere qualche goccia di Dii satura in alcool per una piccola quantità di polvere di ferro (ferro ridotto, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) a temperatura ambiente e lasciare asciugare. (Questo fa sì che di solito le particelle di torta insieme una volta l'alcool è evaporato.) Utilizzare la punta di una micropipetta tirato per rompere le particelle di ferro agglomerato,trasferirli in una provetta, e risciacquare più volte e coprire con acqua deionizzata.
- Per etichettare le cellule ectodermiche in una fase embrionale HH 5, posto l'embrione raccolto (ad esempio, l'intera assemblea carta da filtro) lato dorsale in un piatto di cultura 35 millimetri coperte con uno strato generoso di terreni di coltura e mettere il piatto sotto un microscopio da dissezione. Utilizzare un ago di vetro per rimuovere la membrana vitellina ed esporre le cellule ectodermiche. (Fare attenzione a non forare embrione.)
- Disegna una colonna di particelle di ferro etichettati (in acqua deionizzata) in una pipetta Pasteur. Utilizzando il microscopio a dissezione, immergere la punta della pipetta sotto la superficie del liquido e la posizione appena sopra l'embrione. Ruotando la pipetta lentamente avanti e indietro tra la punta delle dita, spingono le particelle fuori dal pipiette e cospargere tutto l'embrione.
- Una volta che l'embrione è coperta di particelle, con cura posto in un incubatore a 37 ° C per circa 10 minuti. Prendete embrione fuori dell'incubatore unod utilizzare un forte magnete per rimuovere le particelle.
- Utilizzare un microscopio a fluorescenza con telecamera collegata e appropriate impostazioni del filtro per l'acquisizione sia del campo luminoso e le immagini fluorescenti dell'embrione, come mostrato nella Figura 2A, B.
- Nota la densità etichetta. Se una distribuzione più densa si desidera, utilizzare particelle aggiuntive (come descritto sopra) di etichettare l'embrione di nuovo e prolungare il tempo di incubazione di conseguenza. Se le etichette sono troppo denso, aggiungere una piccola quantità di particelle di ferro senza etichetta alla provetta contenente particelle già etichettati e mescolare il contenuto della provetta. Ripetere il processo di etichettatura con un nuovo embrione e ancora nota la densità etichetta.
3. Etichettatura microsfere di polistirolo Optical Coherence Tomography (OCT) Imaging di HH11-12 embrioni
- Preparare una soluzione di nero 10 micron di diametro microsfere (Polysciences Inc., Warrington, PA) in PBS in un piatto di 35 millimetri di Petri. (Perle dovrebbe essere grande abbastanza per generare contrasto per ottobreimaging, ma abbastanza piccolo tale che la dimensione tallone è nell'ordine delle singole cellule. Valori specifici variano a seconda della risoluzione del sistema di Office e dei tessuti in fase di studio). Una goccia di soluzione di riserva (2,6% di solidi-lattice) per ml di PBS è generalmente sufficiente. Tirare questa soluzione in una siringa da 10cc con un 22 gauge. Vortex la soluzione per 30 secondi per garantire una distribuzione uniforme del tallone.
- Smussare la punta delle siringhe di vetro tirato con un disco rigido del computer 2. Diametro della punta dovrebbe essere grande abbastanza da sfere possono passare attraverso l'apertura, ma al tempo stesso, il più piccolo possibile per minimizzare ferimento dei tessuti durante l'iniezione.
- Riempire un ago smussato in vetro con la soluzione tallone utilizzando la siringa. Flick leggermente la micropipetta per garantire che la soluzione ha raggiunto la punta.
- Utilizzando un micromanipolatore, posto l'ago di vetro nello stesso campo di vista dell'embrione. Perline dovrebbe essere che esce la punta della pipetta.
- Se non beads uscita la micropipetta, ci può essere uno zoccolo. In questo caso, ripetere i passaggi 3,2-3,4 con un ago di vetro nuovo.
- Se perline troppe nuvole il tuo campo visivo, la punta della pipetta potrebbe essere troppo ampio. Ripetere i passaggi 3,2-3,4 con una pipetta nuova e un nuovo embrione.
- Inserire la punta della pipetta nel lume del tubo cervello. Fare attenzione a non forare il piano ventrale del tessuto. Vedrete un gonfiore transitorio del tessuto come perline e liquido entrare nel lume. Ciò indica una intubazione di successo, ora, rapidamente rimuovere l'ago di vetro.
- Verificare una densità sufficiente tallone nel lume interno del tubo cervello utilizzando un microscopio a campo luminoso. Lasciate che le perle accontentarsi di 20 - 30 minuti prima di procedere alla Sez. 4.
4. Acquisizione Dati
* I seguenti metodi sono adatti per la tecnica di etichettatura fluorescenza descritto sopra. Tuttavia, con la tecnica di etichettatura microsfere, perline può rimuovere durante il trasferimento dei campionitra incubatori e sistemi di imaging. In questo caso è meglio passare al punto 4.2 (che evita il movimento del campione / agitazione in tutto). In entrambi i metodi, gli embrioni vengono coltivati in immersione nel terreno di coltura liquido. Se l'embrione non è completamente sommersa (come è il caso di alcune tecniche tradizionali colture di tessuti), la geometria dei tessuti è notevolmente alterato da anormalmente elevati carichi tensione superficiale e distribuzioni di tensione non riuscirà a catturare con precisione normale in 3-D morfogenesi 3, 4. Inoltre, immergendo il tessuto evita il contrasto luminoso osservato il liquido-gas durante Ottobre immagini da oscurare morfologia embrionale e le coordinate dei marker.
- Embrione Cultura (generale)
- Dopo aver acquisito le immagini prima (campo chiaro, fluorescenza o ottobre), presentato a piatti 35 millimetri sette cultura (con embrioni) in una capsula di Petri 150 millimetri e il luogo tutta l'assemblea in un sacchetto di plastica di piccole dimensioni. Aggiungere un paio di gocce di acqua deionizzata per la borsa per l'umidificazionee riempire la borsa con un 95% O 2 / 5% CO 2 miscela. Mettere gli embrioni in incubatore a 37 ° C (Coda Stabiletherm, Asheville, NC) per il tempo desiderato fino alla prossima immagine timepoint. Usando questo metodo, gli esperimenti possono essere eseguiti su embrioni multipli nella stessa giornata.
- Time-lapse cultura (automatizzato)
- Posizionare il embrioni etichettato in un piatto Delta T (35 mm di diametro esterno, 23 mm di apertura centrale con parete laterale rastremata, 0,17 millimetri di vetro spesso, Bioptechs, Butler, PA) contenente 1,2 ml di terreno di coltura.
- Coprire il piatto con un coperchio in vetro conservati a 37 ° C con una Bioptechs Delta T4 controller Dish Cultura (per evitare la condensa). Superfuse l'embrione con un 95% O 2 / 5% CO 2 miscela di gas fornito da un mini-dispositivo di pompa a portata variabile (Fisher Scientific). Prima di raggiungere l'embrione, il calore e umidificare il gas facendolo gorgogliare attraverso acqua deionizzata in un ambiente caldo (<100 ° C) piastra. Uno schema di questo s sperimentaleet-up è mostrato in Figura 1.
- Impostare il software per acquisire automaticamente le immagini a intervalli specificati dall'utente tempo. Per il nostro microscopio a fluorescenza, usiamo Openlab software (PerkinElmer, Waltham, MA), e per il nostro sistema di ottobre, usiamo spazzato Thorlabs source software (Newton, NJ). Poiché questo metodo è attualmente solo in grado di gestire uno time-lapse esperimento un tempo, spesso è meglio lasciare che questi tipi di culture per eseguire durante la notte. Si potrebbe aggirare questa limitazione mediante l'installazione di una fase automatizzata traducibile compatibile sia con l'hardware e il software del sistema di imaging 5.
5. Rappresentante dei risultati:
Le etichette sono tracciati automaticamente (utilizzando Volocity, PerkinElmer) o manualmente (usando il plugin Manuale di rilevamento in ImageJ, NIH) in ogni esperimento. Nella tecnica di marcatura fluorescente, si usa il gridfit routine Matlab per adattarsi superfici 2D attraverso le coordinate marcatore, che consente ceppi di superficie morfogenetiche da calcolare 6, 7. Equazioni standard vengono utilizzati per trasformare questi valori in un sistema di coordinate relative embrionale. In alternativa, nella tecnica di ottobre, le superfici sono generati dai volumi segmentati immagine (ottenuta tramite software standard come Matlab o Caret 8) e ceppi possono essere calcolate nella direzione di curvatura massimo o minimo del campione 9.
Abbiamo usato la nostra tecnica di particelle di ferro per etichettare e tracciare il movimento delle cellule ectodermiche durante la formazione di testa piega in embrione di pollo presto. Come illustrato nella Figura 2A, le cellule marcate sono state distribuite in tutto l'embrione intero. Campo chiaro e le immagini fluorescenti dell'embrione sono stati catturati in tempi diversi durante cultura ex ovo. I movimenti delle etichette tracciato (Fig. 2B, C) sono stati poi utilizzati per calcolare l'evoluzione morfogenetica distribuzioni sforzo durante la formazione di testa piega (Fig. 2D-F).
t "> Allo stesso modo, la nostra tecnica di microsfere di polistirene è stato usato per seguire i movimenti dei tessuti a metà romboencefalo confine del cervello pulcino precoce. Come mostrato nella Figura 3 BD, movimenti tallone sono stati monitorati per 6 ore e le tensioni che caratterizzano la deformazione del tessuto in senso longitudinale e direzione circonferenziale sono stati calcolati dalle coordinate dei marker. noti che questo metodo è in grado di gestire distintamente 3-D deformazioni come perline tendono ad attaccarsi a tutti i lati del lume interno del cervello (fig. 3A).
Figura 1. Schematica del set-up per time-lapse coltura dei tessuti.
Figura 2. Quantificare 2-D deformazioni del tessuto in embrione di pollo primi tracciati utilizzando le etichette fluorescenti. (A) brillante uniti campo / fluorescente immagine di scena HH 5 embrione dopo la rimozione di particelle di ferro. DII-labeled cellule ectodermiche (rosso) sono distribuiti in tutto l'embrione. (B, C) Il movimento di cellule etichettate con ImageJ è stato rintracciato. Spostamenti etichetta sono stati calcolati in coordinate embrione (X, Y). Si noti che A e B sono la stessa immagine. (DF), curve di livello di evoluzione distribuzioni deformazione longitudinale durante la formazione del testa piega. Longitudinali ceppi Lagrangiana sono stati calcolati rispetto al HH fase 5 (cioè A e B) dopo (D) 75 min, (E) 120 min e (F) 165 min di incubazione. Questi ceppi caratterizzano i cambiamenti lunghezza della linea di elementi originariamente orientato lungo l'asse Y (nell'embrione fase 5). Ulteriori dettagli sull'uso di etichetta tracciato le coordinate per calcolare ceppi morfogenetici può essere trovato in Filas et al. (2007) 6 e Varner et al. (2010) 7. Si noti che C e F sono la stessa immagine. Barra di scala = 500 micron.
Figura 3. Quantificare in 3-D tessuto deformations nel cervello pulcino precoce. (A) polistirolo microsfere che aderiscono alla (freccia nera), dorsale e ventrale (freccia bianca) i lati del tubo cervello sono facilmente distinguibili dai tessuti circostanti in vista trasversale croce section.Ventral ricostruzioni di ottobre mostrano luoghi microsfere vicino alla metà del rombencefalo confine a (B) HH12 e dopo (C) 6 ore di incubazione (M: mesencefalo, H: rombencefalo). Diversi gruppi di perline sono delineate per evidenziare la deformazione complessiva del tessuto. (D) longitudinale (E zz) e circonferenziale (E θθ) ceppi lagrangiani sono stati calcolati da queste deformazioni. Positivi e negativi ceppi longitudinale circonferenziale a metà romboencefalo confine riflettono un assiale allungamento e accorciamento circonferenziale di questa regione durante cultura. Ulteriori dettagli sul calcolo ceppi morfogenetica per superfici complesse durante la morfogenesi si trovano in Filas et al. (2008) 9. Barra di scala = 200 micron.
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Discussion
Due tecniche di etichettatura dei tessuti vengono presentati per la cultura ex ovo di embrioni di pollo precoce. Il primo utilizza coloranti fluorescenti lipofile forniti tramite particelle di ferro magnetico di etichettare simultaneamente centinaia di cellule. Tuttavia, questo metodo non è attualmente compatibile con tomografia a coerenza ottica, come tinture fluorescenti mostrano generalmente poco contrasto da tessuti circostanti con 10 ott. Quindi, ci mostrano una tecnica alternativa utilizzando microsfere di polistirolo per etichettare i tessuti per i time-lapse analisi ottobre Questa tecnica produce serie di dati 3-D, ma bisogna fare attenzione a non spostare le sfere dal tessuto. Utilizzando uno di questi metodi nella impostazione appropriata sperimentale dovrebbe fornire un'etichettatura affidabile tessuti ed ex ovo sviluppo in embrioni precoci. Entrambi i metodi utilizzano facilmente disponibili, relativamente a basso costo dei materiali (ad esempio, polvere di ferro, polistirolo microsfere) e attivare la deformazione del tessuto da quantificare durante la morfogenesi. Ilmarcatori tessuto in entrambi i casi possono essere facilmente riproducibile e applicata a tessuti embrionali e non richiedono attrezzature specializzate, rendendo questi esperimenti accessibile ai nuovi arrivati nel campo. Visualizzare e analizzare i dati risultanti (ad esempio, calcolando le mappe ceppo morfogenetici) dovrebbe contribuire a illuminare i meccanismi della morfogenesi nel sistema modello 6, 7, 9, 11, 12.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concede GM075200 R01 e R01 HL083393 (LAT). Riconosciamo il supporto borsa di studio per BAF dal NIH T90 DA022871 Mallinckrodt e l'Istituto di Radiologia, e per VDV da concedere 09PRE2060795 dalla American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM — high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments, Inc. | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences, Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
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